1. Historia de la investigación del eccDNA
Primero, echemos un vistazo a qué es el ADN circular. El ADN circular es una forma común de ADN en biología, como el ADN mitocondrial común, el ADN del cloroplasto, los genomas bacterianos, los plásmidos bacterianos y algunos genomas virales. Entonces, ¿cuál es la diferencia entre el ADN circular extracromosómico analizado en este artículo y las formas anteriores? Todos sabemos que tanto el ADN mitocondrial como los plásmidos existen en forma de ADN lineal. Sus componentes de cromatina no tienen histonas, por lo que no existe una estructura de nucleosoma y no se producirá el plegamiento de la secuencia cromosómica ni la estructura terciaria. Dado que el eccDNA se llama ADN circular extracromosómico, primero debe existir en eucariotas (procariotas, orgánulos, virus, etc.). En segundo lugar, debe existir en forma circular. Además, tiene una estructura de nucleosoma completa, es decir, su composición de cromatina es la misma que la de los cromosomas normales, por lo que también tiene plegamiento, compresión y estructura espacial única de la cromatina.
Ya en 1965 se informó sobre ADN circular externo teñido. Esta fue la primera vez que se encontró ADN en células del endospermo del trigo y en el esperma de cerdo.
Ese mismo año, otros investigadores informaron que se encontró ADNecc en células tumorales humanas y descubrieron que existían en pares, por lo que fueron llamados "microcuerpos dobles". Esta fue la primera vez que se utilizó el concepto de doble. Se propusieron microcuerpos. (Tenga en cuenta que los pequeños puntos negros que aparecen en pares junto a los cromosomas en la imagen siguiente son microsomas dobles).
Luego, algunos estudios han descubierto que los microsomas dobles pueden portar genes cancerígenos, como los genes EGFR y MYC. , a través de eccDNA 40 se amplifica en células tumorales (Cancer Genetics y cello Genetics, 2008). En el glioma, se descubrió que las células cancerosas causaban una amplificación masiva de los genes EGFR y MYC mediante la formación de eccDNA (PNAS, 2014).
Aunque muchos resultados de investigación se basan en el estudio de micros dobles, estudios posteriores han demostrado que no todo el eccDNA existe en forma de micros dobles. En 2017, Nature publicó el primer estudio de eccDNA a gran escala en 17 muestras de tumores y descubrió que solo ~30% del eccDNA existía en forma de microsomas dobles. También demostró que diferentes eccDNA prevalecen en diferentes muestras de tumores, pero su contenido varía mucho.
Se puede decir que a partir de este artículo de 2017, la investigación del ADNecc realmente ha entrado en la era de la secuenciación de alto rendimiento. Hasta ahora, incluye principalmente los siguientes artículos:
2017: Nature, al secuenciar 2572 líneas celulares de 17 tumores, demostró que el eccDNA es ubicuo en los tejidos tumorales.
2018: Nature Communications, se aislaron más de 100.000 tipos de eccDNA de músculos y células sanguíneas de personas sanas, y la mayoría de ellos portaban genes o fragmentos de genes, lo que demuestra que el eccDNA es ubicuo en los tejidos normales;
2019: "Nature Genetics", remodelación del genoma impulsada por el ADN ECC en neuroblastoma;
2019: La naturaleza y el ADNecc promueven la accesibilidad a la cromatina y la alta expresión de oncogenes;
2019 : Células, amplificación de oncogenes extracromosómicos causada por potenciadores de funciones;
En segundo lugar, el posible mecanismo de formación del eccDNA
Acerca de cómo se forma el eccDNA Sí, aún no hay una explicación definitiva.
Actualmente se especula sobre los siguientes posibles mecanismos: (a) Se forma una estructura en horquilla durante la replicación del ADN, y luego se desliza para formar un bucle bajo la acción de la ADN polimerasa, que se corta del cromosoma y se replica para formar un ADN circular bicatenario. . Este patrón de formación se caracteriza por la eliminación de esta secuencia en su ubicación original en el cromosoma (b) cuando se replica el ADN, se forma una estructura de bucle R; En esta estructura, una de las hebras se pliega para formar una estructura de anillo y se corta para formar ADN circular. Las dobles hebras rotas se complementan con el mecanismo de reparación del daño del ADN, por lo que este método no causará daño a la secuencia cromosómica original; (c) se forma por replicación de doble hebra a través del modelo Doira y no destruirá la secuencia original; (d) Mediante la recombinación de regiones homólogas de doble cadena, ambas cadenas se rompen simultáneamente, lo que a menudo da como resultado un eccDNA más grande por encima de Mb, y la secuencia original se eliminará.
Por lo tanto, en términos generales, la formación de eccDNA depende de las características de la secuencia del ADN, del proceso de replicación y de la reparación del daño del ADN. A juzgar por el progreso de la investigación actual, en términos de características de secuencia, las repeticiones en tándem conducirán más fácilmente a la formación de eccDNA; y la mayoría del eccDNA tiene secuencias repetidas, pero una parte considerable no tiene secuencias repetidas y no puede recombinarse con ninguna secuencia cercana alta; GC y activación transcripcional La formación y reparación de regiones (como los bucles R) promueven la formación de eccDNA. La recombinación homóloga eliminará el ADN duplicado para producir ADNecc con una secuencia más grande. En términos de reparación de daños en el ADN, se ha descubierto que los carcinógenos aumentan los niveles de ADNecc. Algunas proteínas específicas de reparación de daños en el ADN son necesarias para la formación de ADNecc, pero otras no. Finalmente, aunque la mayor parte de lo que mencionamos en los mecanismos hipotéticos de formación del eccDNA se relaciona con la replicación del ADN, de hecho, el eccDNA puede existir sin replicación del ADN. Por tanto, la formación de eccDNA no es un proceso simple, sino un proceso que involucra múltiples factores, múltiples proteínas y mecanismos reguladores complejos, y tiene funciones biológicas muy importantes.
En tercer lugar, el tamaño y el tipo de eccDNA.
El tamaño del eccDNA varía desde unos pocos cientos de pb hasta decenas de Mb. El más pequeño se llama MicroDNA, según informó Science en 2012. El ADNecc tiene un tamaño de sólo 200-400 pb y algunos fragmentos son demasiado cortos para transportar la secuencia genética completa. Sin embargo, actualmente se cree que el MicroDNA tiene algunas funciones reguladoras importantes, incluida la regulación del proceso de transcripción del ARN o la regulación de la expresión de algunos ARN no codificantes mediante el papel de esponjas moleculares. Al mismo tiempo, este ADN también se considera una forma de ADN libre in vitro y puede usarse en biopsias líquidas para monitorear la aparición y desarrollo de cáncer en el futuro. La forma de doble microcuerpo del eccDNA es generalmente más grande, de 100 kb a 3 Mb, etc. Muchos de ellos pueden observarse bajo microscopía óptica y pueden portar algunas estructuras genéticas completas y secuencias reguladoras aguas arriba. Esta forma de eccDNA a gran escala, similar a las microformas dobles o no dobles, es también la forma con mayor probabilidad de portar una estructura genética funcional completa, lo que atrae la mayor atención, y también es la forma que es relativamente fácil de llevar a cabo a continuación. investigación de puesta en marcha.
En cuarto lugar, la función del eccDNA
Actualmente, se ha demostrado que el eccDNA tiene una variedad de funciones, incluida la mediación de la senescencia celular, como el anillo de rDNA en la tabla anterior, que tiene Se ha demostrado que desempeña un papel en las células de levadura. Desempeña un papel en el proceso de envejecimiento; en el estudio de los genes que codifican las histonas H2A-H2B, se encontró un efecto de compensación genética, los genes homólogos en el ADNecc se amplificarán significativamente. La evolución adaptativa y la heterogeneidad de los tumores se informaron en varios artículos en 2019. Resistencia a los medicamentos Ya en 1978, se demostró que los microorganismos gemelos que portaban el gen DHRF podían causar resistencia al metotrexato en células de ratón. En 2014, un estudio encontró que las mutaciones del gen EGFR en el ADNecc pueden provocar resistencia a los medicamentos en el glioma (Science, 2014).
La especulación sobre la heterogeneidad entre células se debe principalmente a que no hay una estructura de centrómero en el ADNecc y se distribuirá aleatoriamente a las células descendientes cuando las células experimenten mitosis.
Sin embargo, no se ha visto si existe un mecanismo especial que regule la distribución del eccDNA después de la replicación temprana, cuando las células se preparan para dividirse.
Después de que el eccDNA se distribuya aleatoriamente, mantendrá la ventaja del crecimiento celular, que puede ser uno de los mecanismos responsables de la heterogeneidad de los tejidos tumorales y los cánceres primarios/metastásicos. Sin embargo, actualmente no existe ningún método para detectar eccDNA a nivel de una sola célula, por lo que es difícil reconocer la heterogeneidad y las interacciones entre las células, y no se han informado otros estudios.
Método de análisis de eccDNA del verbo (abreviatura de verbo)
Las investigaciones actualmente informadas sobre eccDNA basadas en métodos de secuenciación de alto rendimiento se basan todas en el software AmpliconArchitect desarrollado por el equipo de Paul S. Mischel. . Basado en datos de secuenciación del genoma de segunda generación (profundidad de cobertura 5-10X), el software puede comparar genomas automáticamente, encontrar información de puntos de interrupción, combinar resultados de análisis SV y CNV y generar resultados de análisis eccDNA. Sin embargo, cabe señalar que la licencia de este software actualmente es de pago.
Sin embargo, también podemos considerar la obtención de eccDNA mediante la extracción de ADN circular y la amplificación por círculo rodante, para luego realizar la posterior secuenciación y ensamblaje. En este momento, las restricciones a la dependencia del software son relativamente pequeñas, pero la eliminación del fondo del ADN lineal sigue siendo un problema y aún se necesita mucha exploración en la extracción, amplificación, control de calidad y análisis posterior del ADN genómico.
12 de abril de 2020, Pekín