Las sondas incluyen sondas de ADN y sondas de oligonucleótidos.
Los métodos de etiquetado de sondas incluyen: etiquetado con cebador aleatorio, método de traducción de mella y método de etiquetado final.
La traducción de la mella se produce cuando la mella genera grupos 3' hidroxilo y 5' fosfato, el ADN se extiende para sintetizar el extremo 3', el extremo 5' se degrada en pequeños fragmentos y el sitio de la mella se mueve a lo largo del doble hebra hacia el extremo 3' Es una tecnología que introduce nucleótidos marcados radiactivamente en moléculas de ADN in vitro.
La síntesis de cebadores aleatorios consiste en combinar cebadores oligonucleotídicos con plantillas de ADN y sintetizar sondas de ADN bajo la acción de la enzima Klenow.
El método de marcado final utiliza la desoxirribonucleotidil transferasa terminal para catalizar la adición de dNTP marcado al extremo 3' de ADN mono o bicatenario.
Notas sobre la síntesis de la sonda
①La longitud de la sonda sintetizada generalmente está entre 20 y 50 nucleótidos. Si la síntesis es demasiado larga, el costo será alto y es probable que se produzcan errores en la síntesis de la polimerasa. El tiempo de hibridación será largo. Si la síntesis es demasiado corta, la especificidad disminuirá.
②La composición de base G-C debe contener entre un 40% y un 60%, y no se deben realizar más de 4 repeticiones consecutivas de una base para evitar hibridaciones no específicas.
③ No debe haber ninguna región complementaria dentro de la secuencia propia de la sonda para evitar crear una estructura en "horquilla" y afectar a la hibridación.
En resumen, una buena investigación puede finalmente confirmarse en la práctica.