La PCR temprana se utilizaba principalmente para análisis cualitativos. Se denominaba PCR de punto final según la presencia o ausencia de la secuencia objetivo y se utilizaba ampliamente en campos como la identificación de genes y la detección de ácidos nucleicos patógenos.
En 1990, Simmonds y otros determinaron aproximadamente el número de copias del VHC, el VIH y otros patógenos mediante la dilución en gradiente del producto terminal. Este puede ser el primer estudio cuantitativo de PCR. Pero es necesario aclarar que la PCR cuantitativa mencionada aquí no se refiere a la PCR cuantitativa de fluorescencia. No se utilizaban sustancias fluorescentes para monitorear los productos de PCR en ese momento. Hasta 1992, R Higuchi de Roche publicó un artículo en Nature, introduciendo un método de seguimiento dinámico de productos de PCR utilizando bromuro de etidio (EB), que puede ser la primera tecnología de PCR cuantitativa fluorescente. En 1996, ABi Company anunció la tecnología qPCR basada en sondas Taqman. En 1997, Wittwer et al. compararon las propiedades de qPCR basándose en (i) el tinte específico de doble hebra SYBR Green I, (ii) 5'-nucleasa y sonda doblemente marcada, y (iii) la baliza molecular Cy5. Estos estudios sentaron las bases para la posterior aplicación generalizada de qPCR.
Generalmente, la gente está acostumbrada a dividir la QCPR en cuantificación relativa y cuantificación absoluta, pero en esencia, la QCPR solo se puede utilizar para la cuantificación relativa, mientras que la realización de la cuantificación absoluta a menudo requiere la ayuda de "fuerzas externas". . La amplificación por PCR es una amplificación exponencial. En un estado ideal, la concentración del producto tiene la siguiente relación con la concentración inicial: N T = N 0 × 2 n (N 0 representa la concentración inicial, N T representa la concentración final y N representa el número de ciclos de ambos lados). la fórmula se puede obtener mediante logaritmos: log N T = logN 0 n×log2 (log representa el logaritmo basado en la constante natural E). Si fijamos la señal de juicio del punto final de qqPCR a un valor unificado (es decir, el umbral de fluorescencia en QCPR), entonces el logaritmo del número de ciclo y la concentración inicial se vuelven lineales. Este es el principio básico de la cuantificación relativa de QCPR. Pero hay dos factores: (1) el ojo humano no puede juzgar con precisión la señal del punto final de la PCR, por lo que apareció un instrumento de PCR de fluorescencia especial (2) la eficiencia de amplificación de diferentes genes objetivo es diferente y no se puede comparar directamente; así nace Ct Dharma.
La verdadera PCR cuantitativa absoluta se llama PCR digital (dPCR, el concepto de PCR digital fue propuesto por primera vez por Kinzler et al. en 1999, se basa en la PCR de punto final y la dilución extrema y calcula la). número de copias mediante distribución de Poisson. En el estudio de Simonds et al., diluyeron las moléculas de ADN en una sola copia y luego calcularon el número de moléculas del gen diana basándose en la señal final de la PCR y la ley de distribución de Poisson. Sin embargo, no desarrollaron más esta tecnología, que durante mucho tiempo se caracterizó por el conteo molecular. Por un lado, la QCPR ha suprimido la dPCR durante mucho tiempo y, por otro lado, está limitada por el equipo de detección. No fue hasta 2006 que la DPCR mostró paulatinamente una recuperación tecnológica.
En 1993, Zachar et al. introdujeron los principios matemáticos de la cuantificación relativa por PCR de genes diana en la investigación de ácidos nucleicos. Livak KJ et al. introdujeron el proceso de derivación, las limitaciones y las aplicaciones del método 2-Ct en 2001.
Por supuesto, estos principios son muy simples y fáciles de entender incluso sin leer el artículo.
Debido a la amplificación exponencial de la PCR, cuando fijamos el estándar para juzgar el punto final, la muestra con una cantidad de plantilla inicial alta llega primero y la muestra con una cantidad de plantilla inicial baja consume más ciclos. Cada ciclo significa que la concentración inicial difiere en. 2 veces, es decir, N1 /N2 = 2-(Ct1-Ct2). Al detectar diferentes muestras, Ct puede verse afectado por diferencias en el tamaño de la muestra, por lo que se introduce una corrección del gen de referencia interno. Generalmente se considera que los genes de referencia internos, también conocidos como genes de mantenimiento o genes de mantenimiento, mantienen una expresión constante en diferentes organizaciones temporales y espaciales de los organismos. Entonces, ¿cuáles son los genes de referencia internos de las dos muestras? Ct representa la diferencia en el tamaño de la muestra, ¿gen diana? ¿Gen de referencia interno CT? Ct es la verdadera diferencia de expresión del gen diana, que es el método 2-Ct.
Sin embargo, hay varias cuestiones que deben tenerse en cuenta: (1) PCR no siempre está en la fase de crecimiento exponencial y la comparación debe realizarse en la fase de crecimiento logarítmico (2) Generalmente, el valor predeterminado; La eficiencia de amplificación en la fase de crecimiento logarítmico es 100, lo cual no es riguroso, especialmente para algunas plantillas que son difíciles de amplificar, la eficiencia puede ser bastante diferente de 100 y la expresión de un gen (como el gen A) se analiza longitudinalmente. Es posible que seguir usando 2-Ct no sea exacto. (3) La eficiencia de amplificación de diferentes genes objetivo es diferente, por lo que pueden producirse grandes errores al comparar diferentes genes objetivo horizontalmente.
En vista de esto, al diseñar cebadores, intente mantener la longitud objetivo, GC y Tm lo más cerca posible para garantizar una eficiencia de amplificación similar. PrimerBank y qPrimerDB son excelentes sitios web de recuperación de cebadores QCPR en el país y en el extranjero, respectivamente. Incluyen datos de cebadores QCPR de una gran cantidad de especies y tienen cierto valor de referencia. Además, Pfaffl et al. (2001) y Rao (2013) hicieron algunas modificaciones al método 2-Ct. El método utilizado fue principalmente para corregir la eficiencia de amplificación diluyendo el mismo gradiente de plantilla, que tiene cierta importancia de referencia.
Existen dos métodos para la cuantificación absoluta de qPCR: (1) Primero, obtener un gen de referencia con un número de copias conocido, luego obtener la proporción del gen objetivo con respecto a esta referencia y luego obtener una muestra de prueba precisa. basado en el número de valor conocido. Desde esta perspectiva, la cuantificación absoluta es una cuantificación relativa con la ayuda de la fuerza externa del "número de copias conocido". En 1990, este principio fue descrito por Gilliland et al. (2) Según el método informado por Simmonds en 2), la plantilla de ADN se diluye hasta el límite hasta que el sistema de PCR contiene solo una molécula plantilla. En este momento, el número de copias del gen diana en la muestra se puede obtener simplemente multiplicándolo por el factor de dilución. Este método es un prototipo técnico de dPCR y es muy difícil de implementar en la práctica. Una es que se requieren muchos gradientes de dilución y la otra es que a menudo es difícil amplificar el sistema común de 10-20 uL usando solo una molécula plantilla.
La aplicación más utilizada de la cuantificación absoluta es el recuento molecular, como la determinación precisa del número de moléculas de ARN y la identificación del número de copias de genes en genomas de ADN. La hibridación Southern es el método más utilizado para identificar el número de copias de genes extraños. Sin embargo, con el desarrollo continuo de la tecnología QCPR, hay cada vez más informes sobre la identificación del número de copias basados en la cuantificación absoluta de QCPR. Una gran cantidad de estudios han demostrado que los resultados obtenidos por el método QCPR son básicamente los mismos o incluso más precisos. . Song et al. (2002) utilizaron qRT-PCR para estimar el número de copias del transgén en callos y plantas de maíz transgénicos, y este estudio también utilizó la hibridación Southern para volver a medir el número de copias del transgén "exacto" en callos y plantas de maíz. Por lo tanto, los resultados de la medición de qRT-PCR estaban altamente correlacionados con los resultados "precisos", por lo que creyeron que qRT-PCR podría usarse como un medio eficaz para evaluar el número de copias del maíz transgénico.
La clave para la identificación del número de copia es obtener un estándar con un número de copia conocido. Los plásmidos son fáciles de extraer y purificar, por lo que a menudo se utilizan para construir estándares cuantitativos absolutos. Purifique el plásmido recombinante que porta el gen diana hasta alcanzar una pureza muy alta, mida con precisión su concentración de ácido nucleico y calcule el número de copias estándar según la fórmula: n = 6,02 × 1023 (copia/mol) × M ADN (gramo) / ( Longitud del ADN (BP)) × 650 (g/mol/BP), donde n representa el número de moléculas. Utilice este estándar para dibujar la curva estándar de logN y ct, y luego calcule el número exacto del gen objetivo según el. Valor Ct del gen diana.
Al mismo tiempo, debemos seleccionar un gen de referencia que se conoce al copiar un gen del genoma, dibujar una curva estándar, usar el mismo método para contar moléculas y luego determinar la cantidad de moléculas del gen objetivo y del gen de referencia. en la muestra unificada y agréguelos a la fórmula anterior para obtener el número de copia real del gen objetivo. Generalmente, los genes con un número de copias bajo y una alta conservación dentro de la especie deben seleccionarse como genes de referencia.
Existen muchas formas de identificación del número de copia y no es necesaria una curva de doble estándar. Si se puede confirmar que la eficiencia de amplificación del gen objetivo y el gen de referencia es cercana a 100, también se puede utilizar el método 2-Ct para determinar el número de copias del gen objetivo utilizado por Lin Weishi et al. este método para obtener resultados de identificación del número de copias consistentes con la hibridación Southern.
Existen muchos métodos de genotipado. Landegren et al. (1998) resumieron una variedad de métodos técnicos de genotipado, entre los cuales qPCR y secuenciación son los métodos más utilizados. El método de secuenciación es el más preciso y puede descubrir nuevos genotipos. Es el estándar de oro para la genotipificación o detección de SNP, pero es lento y complicado de operar. La detección QPCR es sencilla, extremadamente rápida y actualmente se utiliza ampliamente.
El principio básico del genotipado por qPCR es que los cebadores con desajustes en el terminal 3' normalmente no pueden amplificar el gen diana. En 1989, Wu et al. y Newton et al. informaron sucesivamente el uso de ASPCR para detectar alelos. Este método es fácil de entender. Suponiendo que se sabe que el sitio SNP es A/T, si se puede juzgar que la señal final generada por el producto de PCR del cebador 3'-A es el genotipo, entonces la señal final generada por el cebador 3'-T es el genotipo T y la señal final generada por los dos cebadores. Todas las señales están mezcladas. En 1995, Livak et al. informaron de un método para detectar SNP utilizando sondas con diferentes etiquetas fluorescentes. Este método diseñó dos sondas con diferentes etiquetas fluorescentes para los dos genotipos y configuró productos puros y controles de genotipo. Usando la amplificación por PCR, si la señal de fluorescencia está cerca de la referencia A, representa el genotipo A, y si está entre A y B, es heterocigota (como se muestra en la figura siguiente).
En 2003, Papp et al. informaron sobre un método de tipificación de SNP basado en curvas de fusión de alta resolución, que también se basó en cebadores no coincidentes del extremo 3'. El genotipo a ha diseñado cebadores de longitud normal, mientras que el genotipo B agrega de 10 a 15 pb de secuencia de GC alta en el extremo 5' del cebador. Después de la amplificación de qPCR, la Tm de productos de diferentes genotipos cambiará, lo que depende de la alta resolución del instrumento de qPCR.
Después de 1995, el número de artículos de investigación relacionados con qPCR aumentó exponencialmente, convirtiéndose en uno de los campos más populares de la biología molecular. En los últimos años, con el auge de la industria del diagnóstico molecular, la qPCR ha desempeñado un papel cada vez más importante en el campo médico. Con el rápido desarrollo de qPCR, también han surgido algunos problemas, como estándares de juicio inconsistentes, falta de estándares unificados para la precisión de la detección y falsos positivos graves en la detección de ARN. En 2009, varios institutos de investigación científica e instituciones médicas publicaron conjuntamente las Directrices MIQE para QCPR, que estandarizaron la terminología común de QCPR, como Ct debería llamarse Cq, RT-qqPCR debería escribirse como RT-QCPR, etc. y estandarizar la sensibilidad, especificidad y precisión del análisis. Además, la guía también proporciona especificaciones detalladas para el procesamiento de muestras, extracción de ácidos nucleicos, transcripción inversa, QCPR e incluso análisis de datos. La guía consta de 9 secciones y 85 parámetros para garantizar la practicidad, precisión, corrección y reproducibilidad de los experimentos de qPCR. Aunque esta guía existe desde hace varios años, seguir estas especificaciones puede hacer que su investigación sea más reproducible y ayudar a los revisores y editores a evaluar rápidamente su manuscrito.
Nota: El contenido y el cronograma de la guía están disponibles aquí: PCR competitiva para un análisis eficiente de múltiples muestras. Ácidos nucleicos Res 1993;21(8):2017-2018.doi:10.1093/NAR/21.8 2017
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