La PCR digital puede calcular directamente el número de copias de la secuencia objetivo, por lo que puede realizar una detección cuantitativa absoluta precisa sin depender de muestras de control y curvas estándar además, porque la PCR digital solo determina la presencia; no hay dos estados de amplificación, por lo que no es necesario detectar la intersección de la señal de fluorescencia y la línea de umbral establecida. No depende en absoluto de la identificación del valor de Ct. Por lo tanto, la influencia de la eficiencia de amplificación de la reacción de PCR digital. se reduce considerablemente y el impacto de los inhibidores de la reacción de PCR se mejora considerablemente. El proceso de distribución de sistemas de reacción estándar en experimentos de PCR digital puede reducir en gran medida la concentración de secuencias de fondo que compiten con la secuencia objetivo. también es particularmente adecuado para detectar mutaciones raras en entornos complejos.
R: El volumen mínimo de carga de gotas está relacionado con los requisitos de sensibilidad de la relación de mutación de su experimento. Los requisitos de carga específicos para el ADNcf humano se pueden ver en la siguiente tabla.
R: Según Poisson Según el principio de distribución, la concentración de ácido nucleico menor o igual a 5 copias/gota (100000 copias/20 ul) puede garantizar que haya gotas de repuesto en toda la población. Conversión estadística, se puede garantizar que los resultados serán estables y no es necesario requerir una sola copia de cada gota. 20.000 gotas corresponden a 100.000 copias de ácido nucleico. Incluso si hay una pérdida en el número total de gotas, el límite de detección correspondiente a 15.000 gotas debería ser generalmente de 75.000 copias.
En teoría, siempre que haya una gota negativa, ddPCR puede calcular el contenido de la muestra según la distribución de Possion, pero el% de CV será muy grande. El rango dinámico aceptable es el rango de contenido de muestra con CV% <5%. Para cualquier plataforma dPCR, la concentración óptima de la muestra es la concentración correspondiente a λ=0,16. En este momento, el CV% es el más pequeño (~1,5%), que corresponde a la cantidad óptima de carga de muestra. Sin embargo, en las pruebas reales, la concentración de la muestra está bien dentro del rango dinámico requerido por la plataforma
Para 20.000 gotas, el límite superior de la concentración de la muestra (teóricamente λ=5,5), la gota positiva correspondiente La proporción es 99,6%, la proporción de gotitas negativas es 0,4% y el número correspondiente de gotitas negativas es 80. Es decir, está bien si el número de gotas negativas supera las 80. De hecho, en teoría puede ser más pequeño, pero considerando otras incertidumbres, este número es relativamente cercano al resultado real de la medición.
Respuesta: El número de gotas es inferior a 9000. Si la cantidad de muestreo es demasiado pequeña, no se puede utilizar la corrección de la distribución de Poisson, especialmente para muestras de alta concentración, el error cuantitativo será mayor y el límite de detección se reducirá. Si hay múltiples orificios, dado que todas las gotas entre los múltiples orificios son sistemas de reacción independientes, los datos de los múltiples orificios se pueden combinar y analizar, y los múltiples orificios se pueden considerar como un solo orificio.
Para el sistema QX200, si el volumen de reacción es de 20 microlitros, el número de gotas generadas es de unas 20.000. El número real de detecciones es inferior a 20.000, a menudo debido al volumen muerto del sistema, la pérdida durante la transferencia de gotas y otros factores inciertos. En otras palabras, una vez preparadas las gotitas, el ácido nucleico objetivo se ha distribuido aleatoriamente entre 20.000 gotitas y se ha establecido el porcentaje de gotitas positivas. Entonces el número de gotitas para el análisis posterior será inferior a 20.000, que no tendrán ninguna. impacto en los resultados cuantitativos (muestra con concentración adecuada). De hecho, también nos hemos encontrado con la misma muestra, diferentes lotes de pruebas, el número total de gotas oscila entre 4.000 y 20.000, pero los resultados cuantitativos no son diferentes. Tenga en cuenta que la afirmación anterior se basa en la "muestra con la concentración adecuada". Si la concentración de la muestra es demasiado alta o demasiado baja, el número total de gotas analizadas será demasiado pequeño, lo que aumentará el error de submuestreo de otro enlace y el La exactitud y precisión cuantitativa se verán afectadas. Entonces, ¿por qué se definen 8.000 gotas? Por un lado, se basa en la perspectiva del control de calidad. Si no hay tantas gotas, debe haber un problema y se recomienda rehacerlo. En cambio, para muestras con concentraciones ultraaltas o bajas, el error causado por 8.000 gotas es aún menor que el impacto de la gota. error de muestreo de la propia muestra.
R: Factores como proteínas, disolventes orgánicos, tensioactivos y sustancias de alta viscosidad en la muestra, la temperatura ambiente al generar gotas y las condiciones de la PCR afectarán la cantidad de gotas. Se consideró que las muestras de sangre eran principalmente residuos de proteínas y alcohol que no se eliminaron durante el proceso de extracción.
Respuesta: Los cebadores y las sondas generalmente se disuelven en agua o TE y representan una pequeña proporción de todo el sistema de reacción de 20 μl, por lo que tienen muy poco impacto en la fuerza iónica o el pH de la reacción final. sistema. Y la premezcla de reacción de ddPCR en sí misma es un tampón que puede mantener un pH relativamente estable. La muestra generalmente se eluye con TE o agua pura. Si no hay ningún problema con la extracción, básicamente no tendrá ningún impacto en el sistema. La única situación posible es que la concentración extremadamente alta de iones de sal aumente la presión osmótica de las microgotas. afecta el equilibrio de las fases interna y externa. Sin embargo, en general, la sangre humana es una solución isotónica no tendrá una concentración de sal tan alta, a menos que haya un problema con el kit de extracción y la concentración excesivamente alta de iones en la muestra no pueda eliminarse. durante la concentración de la columna. En comparación con las proteínas, los disolventes orgánicos, los tensioactivos y las sustancias de alta viscosidad de la muestra, el impacto de los iones en las microgotas es mínimo.
R: El número final medido de gotas efectivas supera las 10.000. Si no hay una disposición escalonada de las alturas de las gotas en el diagrama 1-D, las gotas se pueden considerar estables.
R: La eficacia de los experimentos de ddPCR debe distinguirse en varios aspectos:
La sensibilidad teórica es 1 copia de ácido nucleico. La sensibilidad real requiere un análisis específico para sus diferentes ensayos y diferentes métodos de extracción. La repetibilidad también es diferente en diferentes rangos de concentración de diferentes ensayos. Necesita literatura de referencia, sus propios experimentos o datos de verificación del registro de dispositivos médicos de la FDA.
En términos generales, rara vez es útil describir la sensibilidad analítica de un instrumento de PCR, porque cada secuencia diferente puede juzgarse como un analito diferente, y se utiliza el mismo método para LLD, BLD y AS de diferentes analitos, los FS son todos diferentes y requieren diferentes direcciones de aplicación y reactivos de aplicación.
R: Los volúmenes de gotas generados por diferentes supermezclas de ddPCR de Bio-Rad son diferentes. Es por eso que durante el experimento de configuración, se debe seleccionar correctamente el tipo de supermezcla correspondiente en el software, y el software llamará automáticamente. correspondiente Se calcula el volumen de gota del reactivo. Los volúmenes de gotas de diferentes reactivos se obtuvieron mediante pruebas durante el desarrollo y se utilizaron en el cálculo del software quantasoft
R: 1. El número de gotas en un solo pocillo no es suficiente, 2. El volumen de carga de la muestra en un solo pozo no es suficiente. 3. Es necesario calcular las medias y los intervalos de confianza entre réplicas técnicas. Si hay repeticiones de la tecnología realizada en el experimento, generalmente se recomienda fusionar las gotas de cada repetición de la tecnología para el análisis, lo que puede mejorar la precisión de los datos
R: En un experimento de ddPCR doble, si Si hay interferencia entre las dos reacciones o competencia (generalmente manifestada en el hecho de que cuatro grupos de gotas no pueden estar en una línea rectangular), será más preciso utilizar el método del lazo para dividir las gotas. (Si hay ejemplos, se pueden discutir en el acto)
Estos dos resultados cuantitativos en realidad no son contradictorios. Sin embargo, para los ensayos de detección de mutaciones desarrollados por ddPCR, aún está abierto a discusión si se debe utilizar el número de copias o la tasa de mutación como LOD. Para la biopsia líquida, puede resultar más práctico analizar los dos resultados de la prueba al mismo tiempo. Personalmente prefiero utilizar la concentración del número de copias, mientras que los resultados de tipo salvaje son esenciales para la IPC. La determinación de las proporciones de mutación puede verse afectada por la preparación de la muestra.
Si se añade una nueva etiqueta fluorescente o la señal de fluorescencia de fondo de la gota negativa parece negativa, se requiere corrección y compensación.