Cuando utilizamos chips genéticos para detectar mutaciones en sitios específicos en secuencias de ADN, ¿cómo debemos diseñar sondas?
Es mejor diseñar una sonda de permutación y combinación.
En la estructura molecular del ADN, dos cadenas de polidesoxinucleótidos están enrolladas alrededor de un eje central completamente diferente para formar una estructura de doble hélice. La cadena de desoxirribosa-fosfato está en el exterior de la hélice, con las bases hacia adentro. Las dos cadenas de polidesoxinucleótidos son complementarias inversas y están conectadas mediante un emparejamiento de bases formado por enlaces de hidrógeno entre las bases, formando una combinación bastante estable.
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido nucleico que transporta la información genética necesaria para la síntesis de ARN y proteínas en las células biológicas. Es una macromolécula biológica esencial para el desarrollo y funcionamiento normal de los organismos.
La secuencia de bases de los nucleótidos del ADN constituye información genética. Esta información genética se puede transformar en ARN mediante el proceso de transcripción, y luego el ARNm que contiene se traduce para producir polipéptidos para formar proteínas. Cómo diseñar sondas para la hibridación in situ
1. Hay muchos tipos de sondas. Primero debes decidir cuál usar, ya sea una sonda de ARN o una sonda de ADN. Durante la hibridación, ARN-ARN. combina La estabilidad es mejor que la del ADN-ARN, por lo que la sonda de ARN tiene las ventajas de una unión fuerte y un fondo bajo. El fondo de la sonda de ADN es ligeramente más oscuro, pero está bien y el método de etiquetado es más simple que el anterior; También existen sondas de oligonucleótidos, este tipo de sonda tiene un peso molecular pequeño y buena permeabilidad, pero su sensibilidad de etiquetado no es alta.
2. En comparación con la inmunohistoquímica, la hibridación in situ es relativamente precisa en la localización. Sin embargo, si la proteína desempeña un papel en el estroma, no puede detectarse mediante hibridación in situ combinada con el análisis de imágenes. También se puede utilizar la hibridación. Transcripción semicuantitativa de genes diana.
3. El primero es el control de la muestra, que incluye control positivo y control negativo; el segundo es el control de la sonda, que se utiliza principalmente para aclarar la especificidad de la sonda; el tercero es el sentido de la sonda conectado; al control negativo, la cuarta sonda sin marcar de inhibición competitiva; el quinto control negativo sin sonda, el sexto control de plásmido, y el séptimo control de sonda irrelevante;
4. Si quieres cuantificar, esta prueba no es factible, por lo que debes hacer Northern. Si quieres mostrar la morfología y localización, lo mejor es combinarla con inmunohistoquímica. 2020-11-05 Diseño de sondas Taqman y selección de fluoróforos
Principios generales: la selección de la sonda debe ser conservadora, la selección del cebador debe ser conservadora, por lo que se debe encontrar un fragmento relativamente conservador de 100-200 pb para el diseño Cebadores y sondas. Es decir, el fragmento de amplificación de la PCR en tiempo real es de 50 pb-150 pb. Cuando no se puede encontrar un fragmento conservado de 150 pb, es necesario asegurarse de que el fragmento de la sonda esté conservado.
Al diseñar sondas y cebadores, considere diseñar cebadores y sondas en ambas hebras al mismo tiempo. Pero cabe señalar que al diseñar una sonda en qué hebra, debe estar cerca del cebador diseñado en la misma hebra (es decir, el cebador aguas arriba). De esta manera, se puede garantizar que durante la amplificación futura, incluso si la amplificación no está completa, todavía se informará una señal fluorescente. La mejor distancia entre los dos es que el extremo 5' de la sonda esté a una base del extremo 3' del cebador aguas arriba, pero también pueden superponerse.
Si no se pueden encontrar una sonda y un cebador adecuados en la secuencia original (1) La distancia entre la sonda y el cebador aguas arriba es demasiado grande, pero la distancia al cebador aguas abajo es cercana 2) Sitio de mutación; Requisitos La señal fluorescente también se puede detectar en el extremo 5' de la sonda, pero en el extremo 3'), y se pueden diseñar cebadores y sondas en secuencias complementarias.
Además, los valores de Tm de sondas y cebadores en PCR en tiempo real son superiores a los valores de Tm de cebadores y sondas de hibridación en PCR ordinaria.
2. Diseño de la sonda
Principios básicos del diseño de la sonda:
1 Conservador: las sondas deben ser absolutamente conservadoras y, a veces, la clasificación se realiza sola. sondear para decidir. En teoría, si una base no está emparejada, es posible que no se detecte. Si no puede encontrar un fragmento completamente conservado, solo puede seleccionar un fragmento con una diferencia de base. Y es mejor colocar las diferentes bases en el medio de la sonda, lo que tendrá poco impacto en la hibridación de la sonda y el fragmento objetivo. Es mejor no tener bases diferentes en ambos extremos, porque los dos extremos no son propicios. hibridación de la sonda. Y es mejor ser A o T, no G o A, porque A y T son dobles enlaces, mientras que G y A son triples enlaces.
2. Longitud de la sonda
La mejor longitud de la sonda Taqman es entre 25 y 32 pb, y el valor de Tm está entre 68 y 72 ℃, preferiblemente 70 ℃. El valor de la sonda es 10°C mayor que el valor de Tm del cebador. Esto asegura que la sonda se une al fragmento diana antes que el cebador durante el recocido. Por lo tanto, es mejor que la sonda sea un fragmento conservado rico en GC para garantizar un valor alto de Tm. Ahora existen sondas Taqman MGB. Etiquetar un MGB después de TAMER puede aumentar el valor de Tm de la sonda. Incluso si el fragmento de sonda es corto, se puede alcanzar el valor de Tm requerido de la sonda Taqman (68-70 °C).
3. El nombre de la sonda
debe marcar la ubicación y longitud de la sonda en el genoma.
4. Cálculo del valor de Tm de la sonda
El valor de Tm se puede calcular utilizando el software oligo o primerpreiemer. Asegúrese de que el contenido de GC en la sonda sea del 30 al 80 %. Se debe evitar la aparición de múltiples bases repetidas en la sonda, especialmente la aparición de 4 o más bases G.
5. Evaluación de sondas
Utilice el software Primerselect en el software DNAstar, haga clic en "createprimercatalog" en el menú "registro" e introduzca el nombre de la sonda en "nombre Posición". , presione la tecla Tab para ingresar "secuencia" y pegue o ingrese la secuencia de la sonda que se analizará. Después de seleccionar toda la secuencia, seleccione "primerselfdimer" en el menú "informe" para analizar el dímero de la sonda. La ventana emergente indica cuántos dímeros tiene la sonda y la evalúa utilizando el valor dG (normalmente se da el peor valor dG; en teoría, cuanto mayor sea el valor dG, mejor). En "primerhairpins" en el menú "informe", analice la estructura de horquilla de la sonda. La ventana emergente indica cuántas horquillas tiene esta sonda y evalúa las horquillas de esta sonda. Durante la PCR de fluorescencia múltiple, es necesario analizar varias sondas con un "dímero de pares".
6. El extremo 5' de la sonda no puede ser G, porque incluso cuando una sola base G está conectada al grupo indicador fluorescente FAM, G puede apagar la señal fluorescente emitida por el grupo FAM, lo que resulta en falso La apariencia de negativo.
7. La posición entre la sonda Taqman y el cebador
La sonda Taqman debe estar cerca del cebador aguas arriba, es decir, la sonda Taqman debe estar cerca del cebador aguas arriba la misma hebra. La distancia entre los dos es preferiblemente una base desde el extremo 5' de la sonda hasta el extremo 3' del cebador aguas arriba, pero también puede superponerse. Asegúrese de que el extremo 5' de la sonda Taqman esté al menos a 4 pb de distancia. el extremo 5' del cebador aguas arriba.
3. Selección de fluoróforos de sonda
Generalmente, el grupo luminiscente en el extremo 5' se puede seleccionar según sus necesidades. Teóricamente, la fluorescencia marcada en el extremo 5' se excita. y emitida por el dispositivo, la longitud de onda debe ser la longitud de onda de excitación del extremo 3', por lo que si usa FAM (uno de los tintes fluorescentes más utilizados) en el extremo 5', la longitud de onda central de la emisión excitada de FAM es 521 nm. , entonces la longitud de onda de excitación debe seleccionarse en el extremo 3' del tinte fluorescente (grupo de extinción) alrededor de 521 nm. El grupo de extinción también emitirá fluorescencia después de ser excitado, es decir, fluorescencia de fondo, lo que aporta ruido a la detección. Por lo tanto, los grupos de extinción no luminiscentes como Eclipse también se usan comúnmente en el extremo 3' para reducir la interferencia de fondo.
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4. Ventajas de la sonda MGB
a. La sonda MGB es más corta (14-20 pb), lo que facilita la búsqueda de regiones conservadas de fragmentos más cortos de todas las secuencias secuenciadas.
b. Después de agregar MGB a las sondas de fragmentos cortos (14-20 pb), el valor de Tm aumentará en 10 °C, lo que facilitará el cumplimiento de los requisitos del valor de Tm de las sondas fluorescentes.
Principios de diseño para sondas MGB:
1) Evite G en el extremo 5' de la sonda, incluso si la sonda está hidrolizada en una sola base, la G conectada al reportero grupo La base aún puede apagar la señal fluorescente del grupo.
2) Utilice el software primerexpress para evaluar el valor de Tm. El valor de Tm debe ser 65-67 ℃.
3) Intente acortar la sonda TaqmanMGB tanto como sea posible, pero la longitud de la sonda no debe ser inferior a 13 pb.
4) Intenta evitar bases repetidas, especialmente bases G, y evita 4 o más repeticiones G.
5) En principio, siempre que haya una mutación de base en la sonda MGB, la sonda MGB la detectará (la sonda MGB no se hibridará con el fragmento objetivo y no producirá ninguna señal fluorescente). Por lo tanto, cuando se realiza la detección de SNP, para detectar mutantes, es decir, TaqmanMGB no se hibrida con el fragmento diana y no produce una señal fluorescente. El fragmento diana de la sonda debe producir una señal fluorescente para la detección. debe colocarse en el medio 1/3 de la sonda tanto como sea posible. Nota: Para cumplir con los cuatro requisitos anteriores, el sitio de mutación de la sonda se puede mover al extremo 3', pero el sitio de mutación está al menos 2 bases delante del extremo 3' (es decir, las dos últimas bases (se debe garantizar la calidad de la sonda) las bases están absolutamente conservadas) para la detección de SNP. Por otro lado, si desea realizar una detección similar, debe buscar regiones de fragmentos conservadas y no debe haber sitios de mutación en la sonda. Si la sonda tiene sólo 13 pb, la sonda todavía no es completamente conservadora. Hay varias mutaciones y el sitio de mutación también debe estar cerca del extremo 5' de la sonda. De esta manera, incluso si hay una mutación, la sonda puede hibridarse con el fragmento objetivo y generar una señal fluorescente. Otro método consiste en diseñar sondas degeneradas, que también puedan detectar mutaciones aunque sean mutaciones.
5. Diseño del cebador
1. Los cebadores ascendentes y descendentes deben ser conservadores.
Para amplificar los fragmentos conservados requeridos, los conservados son 100-200 µ. Los fragmentos se amplificaron por PCR. Por lo tanto, la selección de cebadores debe ser muy conservadora. Lo mejor es no tener bases diferentes. Si es necesario, se debe asegurar que al menos 4 bases en el extremo 3' del cebador estén completamente conservadas.
Al diseñar cebadores conservadores, es necesario buscar regiones conservadas y consistentes en la secuencia publicada, es decir, en el extremo 5' de la secuencia publicada, buscar al menos 5 pb conservados en el extremo 3. ' extremo del cebador. Se encontró que la posición del cebador en el extremo 3' de la secuencia publicada tenía al menos 5 pb conservados en el extremo 5'.
2. La longitud y el valor de Tm de los cebadores ascendentes y descendentes.
La longitud de los cebadores ascendentes y descendentes generalmente está entre 18-25 pb, y el valor de Tm está entre 58- 60°C. Asegúrese de que el contenido de GC en la imprimación sea del 30 al 80 %. Se deben evitar múltiples bases repetidas en los cebadores, especialmente 4 o más bases G. Es mejor si el extremo 3' del cebador no es G o/y C. No debe haber 2 G o/y C en las 5 bases en el extremo 3' del cebador.
El cebador aguas arriba debe marcarse con F (adelante), y su ubicación y longitud en el genoma; el cebador aguas abajo debe estar marcado con R (inverso), y su ubicación y longitud en el genoma. El valor de Tm se puede calcular usando software oligo o primerpreiemer. La diferencia entre los valores de Tm de los cebadores ascendentes y descendentes no debe exceder los 2 ℃, y la diferencia de longitud no debe exceder los 4 pb.
3. Evaluación de cebadores
Utilice el software Primerselect en el software DNAstar, haga clic en "createprimercatalog" en el menú "registro" e ingrese el nombre y la posición del cebador en "nombre". Presione la tecla Tab para ingresar "secuencia" y pegar o ingresar la secuencia del cebador que se analizará. Después de seleccionar toda la secuencia, seleccione "primerselfdimer" en el menú "informe" para analizar el dímero del cebador. La ventana emergente le indicará cuántos dímeros tiene el cebador y lo evaluará utilizando el valor dG (normalmente se da el peor valor dG; en teoría, cuanto mayor sea el valor dG, mejor). En "horquillas de imprimación" en el menú "informe", analice la estructura de horquilla de la imprimación. La ventana emergente le dirá cuántas horquillas tiene esta imprimación y evaluará las horquillas de esta imprimación. Luego seleccione los cebadores ascendentes y descendentes necesarios, vaya a "primerpairdimers" en el menú "informe" y analice los dímeros de los cebadores ascendentes y descendentes. La ventana emergente le dirá cuántos dímeros hay en este par de cebadores y evaluará este par de cebadores utilizando valores de dG (generalmente se da el peor valor de dG. En teoría, cuanto mayor sea el valor de dG, mejor ( (el valor dG suele ser un valor negativo), el valor absoluto que excede 4,5 kcal/mol conducirá fácilmente a la generación de bandas de cebador-dímero y reducirá la concentración efectiva de cebadores de modo que la reacción de PCR no pueda desarrollarse normalmente).
No es necesario considerar el emparejamiento y la estructura en horquilla entre cebadores y sondas porque el valor de Tm de la sonda es muy alto.
4. La distancia entre los cebadores ascendentes y descendentes y la sonda (la posición de los cebadores ascendentes y descendentes)
Teóricamente, la distancia entre el extremo 3' del cebador ascendente y el extremo 5' de la sonda está entre 1 y 20 pb, lo mejor es 1 pb, el extremo 3' más cercano del cebador aguas arriba está a 4 pb del extremo 3' de la sonda; el cebador aguas abajo debe estar en un cierto punto; distancia de la sonda, pero se debe garantizar que el extremo 3' del cebador aguas abajo esté a 4 pb de la sonda. El extremo 3' está preferiblemente a 15-150 pb. La longitud de todo el fragmento objetivo está preferiblemente entre 50 y 150 pb, y el más largo no debe exceder los 200 pb.
5. Diseño de cebadores degenerados
Para amplificar simultáneamente fragmentos diana que tienen mutaciones incluso en el sitio del cebador, si múltiples bases tienen la misma probabilidad de ocurrencia, es necesario En este sitio, diseñe un degenerado que represente múltiples bases. Al sintetizar cebadores, al sintetizar en este sitio, en lugar de agregar una base, se agregan simultáneamente múltiples bases representadas por degenerados. De esta manera, los cebadores esencialmente sintetizados son cebadores múltiples, pero las bases en las subposiciones degeneradas son diferentes. Sin embargo, para los cebadores degenerados, se debe considerar el valor de Tm de cada cebador para garantizar que los valores de Tm de diferentes cebadores para diferentes bases representadas por los degenerados no difieran en más de 2 °C. Si la temperatura supera los 2 °C, mientras se asegura de que los extremos 3' de los cebadores sean iguales, agregue algunas bases al extremo 5' del cebador base con un valor de Tm más bajo para que tengan el mismo valor de Tm. Pero esta vez no son cebadores degenerados, sino dos cebadores con diferentes longitudes, diferentes subsitios degenerados, pero con el mismo valor de Tm, que se sintetizan por separado y finalmente se mezclan en concentraciones iguales.
6. Selección de sondas de PCR multiplex en tiempo real
1. La PCR multiplex en tiempo real tiene dos significados: uno es seleccionar sondas y cebadores conservadores y utilizar diferentes tintes. Las sondas marcadas pueden Se puede utilizar para determinar diferentes productos según el color de la fluorescencia durante la detección. El otro método consiste en seleccionar cebadores conservadores, amplificar fragmentos objetivo de diferentes longitudes, agregar tinte SYBRN a la reacción y, finalmente, determinar diferentes elementos en función de los valores de Tm de diferentes fragmentos objetivo.
2. Las sondas fluorescentes de la PCR multiplex en tiempo real deben ser del mismo tipo: como sondas Taqman, sondas MGB o sondas Beacon.
3. En PCR multiplex, análisis de interferencia mutua entre cebadores y sondas en PCR multiplex.
Después de diseñar cada par de cebadores y sondas, reutilice el software Primerselect en el software DNAstar para abrir el archivo de cebador de PCR multiplex guardado en el mismo archivo y luego seleccione los cebadores multiplex diseñados en pares o después de seleccionar. Las sondas multiplex diseñadas en pares, utilizan "primerpairdimers" en el menú "informe" para analizar los dímeros de los cebadores ascendentes y descendentes. La ventana emergente le dirá cuántos dímeros tiene este par de cebadores y evaluará este par de cebadores con valores de dG (generalmente se da el peor valor de dG; en teoría, cuanto mayor sea el valor de dG, mejor).
4. Impacto de los fragmentos de amplificación por PCR de fluorescencia en tiempo real multiplex
Es mejor amplificar los fragmentos objetivo de la misma longitud en cada múltiplex, pero la longitud no debe ser demasiado diferente. .
5. El mismo subtipo está claramente dividido en varios grupos, pero se desea amplificar todo el subtipo al mismo tiempo.
Primero diseña cebadores y sondas conservadores para cada subgrupo, y luego marca las sondas con el mismo colorante. De esta forma, en la reacción de PCR en tiempo real, aunque es una reacción de PCR múltiple, el informe es. el mismo informe de tinte.
Referencia,
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