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Método general:
Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS para determinar el peso molecular de proteínas
[Principio]
La determinación del peso molecular de las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS es una nueva tecnología desarrollada por Weber y Osborn a finales de los años 1960 por Shapiro et al. Este método de determinación del peso molecular de las proteínas tiene las ventajas de rapidez, conveniencia y equipo simple.
En los métodos generales de electroforesis, la movilidad electroforética de las proteínas depende principalmente de su carga neta, tamaño molecular (es decir, peso molecular) y diferencias de forma a un determinado pH, mientras que la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida depende principalmente de la Peso molecular de la mayoría de las proteínas, independientemente de su carga y forma originales.
SDS es un tensioactivo aniónico. Bajo ciertas condiciones, puede abrir enlaces de hidrógeno y enlaces hidrofóbicos de proteínas y combinarse con estas moléculas de proteínas en proporción para formar un complejo proteína-SDS cargado negativamente. Normalmente se combinan 1,4 g de SDS por gramo de proteína. La combinación de SDS y proteína hace que el complejo proteína-SDS tenga la misma carga negativa, que excede con creces la carga original de la proteína, enmascarando así la diferencia de carga original entre las proteínas. En solución acuosa, el complejo proteína-SDS tiene la misma conformación, asemejándose a una varilla elíptica larga en forma de cigarro (el eje corto es de 1,8 nm, el eje largo es proporcional al peso molecular de la proteína), superando así las diferencias de forma originales. entre proteínas. De esta manera, la movilidad del complejo proteína-SDS en el gel ya no se ve afectada por la carga y la forma originales, sino que es simplemente una función del peso molecular de la proteína. La relación entre el peso molecular de la proteína y la movilidad electroforética se puede expresar mediante la siguiente fórmula:
lgMr = K–BM
Donde Mr es el peso molecular k es la constante; la pendiente;m Es liquidez.
Entonces, para utilizar este método para determinar el peso molecular de una proteína, solo necesita conocer el peso molecular en función de la posición de la proteína que se va a probar en la tabla de movilidad lgMr~ ~ de una proteína estándar. con un peso molecular conocido.
El peso molecular medido por este método, excepto en el caso de las proteínas monocatenarias, no es el peso molecular completo de las proteínas naturales, sino el peso molecular de las subunidades o cadenas peptídicas que forman estas proteínas. Este método no es adecuado para algunas proteínas con carga o conformación anormal, o proteínas con grupos auxiliares más grandes, como la histona F1 y algunas glicoproteínas. Tampoco es adecuado para algunas proteínas estructurales como el colágeno.
La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS se puede dividir en electroforesis en sistema continuo SDS y electroforesis en sistema discontinuo SDS según las diferencias en el tampón, el valor de pH y el tamaño de los poros del gel en el sistema de electroforesis en gel. Según la forma del gel y el método de electroforesis, se puede dividir en dos tipos: electroforesis en tubo vertical de gel de poliacrilamida SDS y electroforesis en placa vertical de gel de poliacrilamida SDS.
Este experimento adopta el método de operación de placa vertical discontinua SDS. A través de experimentos, los estudiantes dominarán los principios y técnicas de la electroforesis en placa vertical de gel de SDS-poliacrilamida, incluida la preparación del gel, el llenado del gel, la adición de muestras, la extracción del gel y la tinción de fijación, y aprenderán a utilizar estos métodos para determinar el peso molecular de las proteínas.
[Métodos y pasos]
1. Preparación de la solución de muestra
1 Preparación de la solución de muestra de proteína estándar Pesar citocromo y quimotripsina Colocar de 0,5 a 1 mg cada uno. de propepsina, ovoalbúmina y albúmina sérica bovina en un tubo de centrífuga pequeño (tubo Eppendorf), agregue 1 ml de solución de muestra, disuelva completamente y centrifugue para eliminar cualquier materia insoluble. Tratamiento térmico al baño maría hirviendo durante 3 minutos, enfriar y reservar.
2. Preparación de la solución de muestra de proteína a analizar.
El análisis cuantitativo de muestras de proteínas se realiza en función de la presencia de la muestra de proteínas a analizar.
(1) Sólido
Para la muestra de proteína que se va a analizar, si se trata de una preparación sólida de proteína pura sin sal, el método de preparación de la solución de muestra es el mismo que el de la solución estándar de muestra de proteína, las preparaciones sólidas de sales de proteína pura deben disolverse completamente en agua, dializarse contra el tampón de diálisis durante 12 a 16 horas, luego pipetear 0,5 ml (la concentración de proteína debe ser de 0,5 a 1 mg/ml), colocar; en un tubo Eppendorf y agregar un volumen igual de concentrado. El líquido de la muestra se trató térmicamente en un baño de agua hirviendo durante 3 minutos, se enfrió y se dejó a un lado.
(2) Líquido
Si la muestra de proteína que se va a analizar es una preparación líquida de proteína pura sin sal, agregue el mismo volumen de solución de muestra concentrada y luego realice el tratamiento térmico; Es una preparación líquida que contiene sal, primero requiere diálisis.
2. Preparación del gel
1. Preparación de la placa de gel
(1) Placa de lavado
Vierta el detergente después de diluir. Lávelo con agua tibia, úselo para remojar una esponja y frote la placa de vidrio, luego enjuáguelo con agua del grifo y séquelo con alcohol.
(2) Instale la placa de goma
Antes de pegar, alinee la placa de vidrio con el borde de la moldura de plástico y la placa de cerámica cóncava, séllela con cinta selladora y use clips de plástico. o hierro por ambos extremos, fijelo asegurándose de que quede sellado y colóquelo en el soporte.
2.Preparación de gel separador y solución de gel concentrado
Ingredientes
Gel separador/ml
Gel concentrador/ml
Solución madre de gel
2,5
0,26
Tampón de gel de separación (pH 8,8)
1,9
p>—
Tampón de gel concentrado (pH6,8)
—
0,5
10% doce Alquilsulfato de sodio
0.075
0.02
Temide
0.026
0.02
Agua bidestilada
3,05
1,22
Persulfato de amonio al 10%
0,013
0,02
Volumen total
7,6
2
Nota: ①Finalmente agregue una solución de persulfato de amonio al 10% y mezcle para formar una solución de gel, vierta el gel rápidamente.
(2) La acrilamida y la metilen bisacrilamida son agentes nerviosos que irritan la piel. Así que asegúrese de no inhalarlo ni entrar en contacto con la piel. El gel de poliacrilamida totalmente polimerizado no es tóxico.
3. Prepare el pegamento de aislamiento
Coloque la placa de pegamento verticalmente, inserte un peine de muestra del espesor correspondiente, marque la línea del borde inferior del peine a 1 cm y retire el peine de muestra. Agregue lentamente la solución de pegamento aislante preparada entre las placas de fabricación de pegamento hasta que el nivel del líquido alcance la marca. Utilice un gotero para pegarlo a la interfaz del pegamento y cúbralo lenta y cuidadosamente con una capa de n-butanol de aproximadamente 0,5 cm de espesor para evitar que la solución se evapore y garantizar una superficie de pegamento suave.
4. Haga gel apilable
Después de la polimerización, vierta el n-butanol, enjuague la superficie del gel dos veces con agua destilada y use papel de filtro para absorber el líquido residual. Utilice un gotero para agregar la solución de pegamento concentrada a la superficie del pegamento de separación, llene la placa de fabricación de pegamento e inserte el peine de muestra.
(3) Electroforesis
1. Instale el tanque de electroforesis.
Después de polimerizar el adhesivo concentrado, retire el peine, la cinta selladora y los seis clips de hierro. Coloque la placa de goma, el núcleo interno del tanque de electroforesis y otro par de placas de goma en el tanque en secuencia. La placa cerámica cóncava de la placa de goma del sistema dual debe estar en contacto con el núcleo interno del tanque de electroforesis. Luego inserte placas de cuña para asegurar los dos juegos de placas de goma. Si solo se utiliza una placa de goma para cada recorrido, el otro juego de placas de goma debe reemplazarse con las placas de plexiglás proporcionadas.
2. Agregue la muestra
Llene los tanques interior y exterior con solución tampón de modo que el nivel de agua en los tanques interior y exterior exceda el espacio de la placa cóncava pero sea más bajo que el borde superior de la placa de plástico. Utilice un micromuestreador para agregar muestra al pozo del peine.
3. Electroforesis
Cierre la tapa superior y realice la electroforesis a un voltaje de 80 V ~ 100 V durante aproximadamente 3 horas hasta que el frente de electroforesis indicado por el azul de bromofenol llegue al borde inferior de la placa de gel y cierre la fuente de alimentación. Luego extraiga la placa de cuña y retire la llave de goma.
(4) Teñido y decoloración
Utilice una cuchilla o un plato fino para separar suavemente el plato de plástico blanco del plato de cerámica y utilice una cuchilla para tirar del plato de plástico blanco. la unión del gel de separación y el gel de apilamiento Corte el gel de separación y corte una pequeña esquina en la esquina superior izquierda del gel de separación para marcar el orden de la muestra. Luego póngase guantes de goma y transfiera con cuidado el gel de separación al recipiente de tinción. Agregue 100 ml de solución de tinción Coomassie Brilliant Blue (que contiene 0,25 % de Coomassie Brilliant Blue R-250, 30 % de etanol y 10 % de solución acuosa de ácido acético) en el recipiente de tinción, cubra la tapa y tiña en una coctelera durante 2 horas.
Vierte la solución de tinte nuevamente en la botella de almacenamiento (reutilizable). Agregue 100 ml de solución descolorante (10% ácido acético, 30% etanol) al plato de tinción, agite bien y descolore hasta que la banda de proteína esté clara.
[Resultados y cálculos]
1. Después de retirar el color de fondo del gel, la banda de color es claramente visible.
Traza o fotografía patrones de electroforesis basados en muestras reales.
2. Calcule la movilidad relativa mr de cada proteína en función de la relación entre la distancia de migración de cada proteína y la distancia de migración del tinte, y luego dibuje el diagrama LGmr ~ mr, a partir del cual se obtiene la MR de lo desconocido. proteína correspondiente al peso molecular.