El método de extracción de plásmidos elimina el ARN, separa los plásmidos del ADN genómico bacteriano y elimina proteínas y otras impurezas para obtener plásmidos relativamente puros.
Existen muchos métodos para extraer ADN plasmídico. Desde el rendimiento de la extracción, se puede dividir en microextracción, extracción media y extracción de grandes cantidades. Desde el uso de instrumentos, se puede dividir en extracción general y. Extracción del método del kit. Según los métodos de operación específicos, se puede dividir en método de lisis alcalina, método de ebullición, método de palillo, etc. Cada método diferente tiene sus propias ventajas y desventajas. Se pueden utilizar métodos de extracción apropiados de acuerdo con diferentes propósitos experimentales. Consulte la "Guía de experimentos de clonación molecular" para obtener más detalles. Además, un artículo del Laboratorio de Química y Biología Molecular de la Universidad de Fudan proporciona una explicación detallada del mecanismo de extracción de plásmidos.
Método de lisis alcalina
Los métodos de lisis alcalina y SDS se han utilizado para aislar y preparar ADN plasmídico de E. coli (E. coli) durante más de 30 años. La exposición de suspensiones bacterianas a detergentes aniónicos fuertes con valores de pH altos rompe las paredes celulares, desnaturaliza el ADN cromosómico y las proteínas y libera ADN plasmídico en el sobrenadante.
Aunque los disolventes alcalinos interrumpen por completo el emparejamiento de bases, las dobles hebras del ADN del plásmido de círculo cerrado no se separan entre sí porque están topológicamente entrelazadas entre sí. Siempre que la intensidad y duración del tratamiento con OH no sean excesivas, las dobles hebras de ADN se volverán a formar cuando el pH vuelva a ser neutro. Durante la lisis, las proteínas bacterianas, las paredes celulares rotas y el ADN cromosómico desnaturalizado se entrelazan entre sí formando grandes complejos, que se recubren con lauril sulfato. Cuando se utiliza K+ en lugar de Na+, el complejo precipitará eficazmente de la solución. Después de eliminar el desnaturalizante mediante centrifugación, el ADN plasmídico renaturalizado se puede recuperar del sobrenadante.
La hidrólisis alcalina en presencia de SDS es una técnica muy flexible, aplicable a todas las cepas de E. coli y que permite volúmenes de cultivo bacteriano desde 1 hasta más de 500 mL.
Método de ebullición
El método de ebullición consiste en suspender las bacterias en un tampón que contiene Triton X-100 y lisozima que puede digerir la pared celular, y luego calentarla a 100 °C para lisarla. él. Además de destruir la pared exterior bacteriana, el calentamiento también ayuda a desentrañar el par de bases de las cadenas de ADN y desnaturalizar las proteínas y el ADN cromosómico. pero. Las cadenas de ADN plasmídico de círculo cerrado no se separan entre sí porque sus cadenas principales de fosfodiéster tienen una topología entrelazada. Cuando la temperatura baja, las bases del ADN de circuito cerrado vuelven a su lugar, formando moléculas superenrolladas. El ADN cromosómico desnaturalizado y las proteínas se eliminan mediante centrifugación y el ADN plásmido se puede recuperar del sobrenadante. El método de lisis por ebullición es muy eficaz para plásmidos pequeños de menos de 15 kb y se puede utilizar para extraer plásmidos desde tan solo 1 ml (preparación pequeña) hasta 250 ml (preparación a gran escala) de líquido bacteriano, y es adecuado para la mayoría de las cepas de E. coli. Sin embargo, este método no se recomienda para cepas de E. coli que pueden liberar grandes cantidades de carbohidratos después de ser tratadas con desnaturalizantes, lisozima y calor. Esto se debe a que los carbohidratos son difíciles de eliminar e inhiben las actividades de las enzimas de restricción y la polimerasa. Grandes cantidades de carbohidratos pueden oscurecer las bandas de ADN plasmídico superenrolladas en la centrifugación en gradiente de CsCl-bromuro de etidio. La cepa de E. coli HB101 y sus derivados (incluido TG1) producen grandes cantidades de carbohidratos y no son aptos para la lisis por ebullición.
Kit de minipreparación de plásmidos
Se utiliza para extraer pequeñas cantidades de ADN plasmídico de E. coli. Combina el método de lisis alcalina optimizado con la cómoda y rápida tecnología de centrifugación con membrana de silicio. y rápido, todas las operaciones se pueden completar en 30 minutos. El kit se puede utilizar para purificar de 10 a 40 μg de ADN plasmídico de alta calidad (OD260/OD280 = 1,7-1,9) de 1 a 5 ml de bacterias E. coli cultivadas durante la noche. Este ADN plasmídico se puede utilizar directamente para el análisis de secuencia de ADN. , varias enzimas que promueven reacciones, PCR y transfección de algunas líneas celulares, etc.