Los sistemas HPLC generalmente constan de bombas de infusión, inyectores, columnas cromatográficas, detectores, dispositivos de registro y procesamiento de datos, etc. Las bombas de infusión, las columnas y los detectores son componentes críticos. Algunos instrumentos incluyen dispositivos de elución en gradiente, desgasificador en línea, muestreador automático, columna o protector, controlador de temperatura de columna, etc. Los instrumentos HPLC modernos también tienen sistemas de control por microordenador para el control automático de instrumentos y el procesamiento de datos. Los instrumentos de HPLC preparativa también están equipados con dispositivos automáticos de recolección de fracciones.
En la actualidad, los fabricantes extranjeros comunes de instrumentos de HPLC incluyen Waters Company, Agilent Company (anteriormente HP Company) y Shimadzu Company, y a nivel nacional están Shanghai Wufeng Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai Hegong Scientific Instrument Co. , Ltd., Dalian Yiyuan Jung Su Company, Beijing Innovation Tongheng Company y Beijing Wen Branch.
1. Bomba de infusión
1. Estructura y rendimiento de la bomba
La bomba de infusión es uno de los componentes más importantes del sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento. El rendimiento de la bomba afecta directamente la calidad general y la confiabilidad de los resultados analíticos. La bomba de infusión debe tener el siguiente rendimiento: ① El caudal es estable y su RSD debe ser inferior al 0,5%, lo que está relacionado con la precisión del análisis cualitativo y cuantitativo (2) El rango de caudal es amplio y el; el tipo analítico debe ajustarse continuamente dentro del rango de 0,1 ~ 10 ml/min. El tipo de preparación debe alcanzar 100 ml/min. ③ La presión de salida es alta, generalmente 150 ~ 300 kg/cm2: ④ El cilindro hidráulico es de tamaño pequeño; ⑤ Buen rendimiento de sellado y resistencia a la corrosión.
Existen muchos tipos de bombas, que se pueden dividir en bombas de presión constante y bombas de flujo constante según la naturaleza de la infusión. Las bombas de flujo constante se pueden dividir en bombas de chorro en espiral, bombas alternativas de émbolo y bombas alternativas. La bomba de presión constante se ve afectada por la sombra de la columna y el caudal es inestable; el cilindro de la bomba de tornillo es demasiado grande y estas dos bombas se han eliminado. En la actualidad, la más utilizada es la bomba alternativa de émbolo.
El cilindro de líquido de la bomba alternativa de émbolo es pequeño, de hasta 0,1 ml, lo que resulta conveniente para limpiar y reemplazar la fase móvil. Es especialmente adecuado para recirculación y elución en gradiente. El caudal se puede ajustar fácilmente cambiando la velocidad del motor y el caudal no se ve afectado por la presión de la columna; la presión de la bomba puede alcanzar los 400 kg/CM2. La principal desventaja del ADW es el gran impulso de salida, que ahora se supera con un sistema de bomba dual. Según el método de conexión, las bombas dobles se pueden dividir en tipo paralelo y tipo serie. En términos generales, la reproducibilidad del flujo de las bombas en paralelo es mejor (RSD es de aproximadamente 0,1% y la de las bombas en serie es de 0,2 ~ 0,3%), pero la probabilidad de falla es mayor (porque hay más válvulas de retención) y el precio es mayor. caro.
En segundo lugar, el muestreador
En los análisis HPLC se utiliza generalmente una válvula de inyección de seis vías (las más comunes son 7725 y 7725I de la empresa estadounidense RHEODYNE), y sus componentes clave. Están hechos de sellos circulares. Consisten en una almohadilla (rotor) y una base fija (estator). Tiene resistencia a alta presión (35 ~ 40 MPa), inyección de muestra precisa, buena repetibilidad (0,5%) y fácil operación. Existen dos métodos de muestreo para válvulas de seis vías: método de llenado parcial y método de llenado completo. (1) Cuando se utiliza el método de llenado parcial para inyectar muestras, el volumen de inyección no debe exceder el 50 % (máximo 75 %) del volumen del bucle cuantitativo, y el volumen de cada inyección debe ser exacto e igual. La precisión y repetibilidad de este método dependen de la competencia del inyector, y es probable que se produzca un ensanchamiento del pico causado por la inyección. (2) Cuando se utiliza el método de llenado de líquido completo para la inyección de muestra, el volumen de inyección no debe ser inferior a 5 a 10 veces 9 o al menos 3 veces el volumen del bucle cuantitativo para reemplazar completamente la fase interna y la fase móvil del bucle cuantitativo. bucle, elimine el efecto de la pared del tubo y garantice la precisión y repetibilidad de la inyección.
En tercer lugar, la columna cromatográfica
La cromatografía es un medio de separación y análisis, y la separación es el núcleo, por lo que la columna cromatográfica responsable de la separación es el corazón del sistema de cromatografía. Los requisitos para las columnas cromatográficas son una alta eficiencia de la columna, buena selectividad y una rápida velocidad de análisis. Gel de sílice poroso, fase aglutinante a base de gel de sílice, alúmina, microesferas de polímeros orgánicos (incluidas resinas de intercambio iónico), carbono poroso, etc. Está disponible comercialmente para HPLC y normalmente tiene tamaños de partículas de 3, 5, 7, 654, 38±00 μm, etc.
, el valor teórico de la eficiencia de la columna puede alcanzar 5160000/m. El análisis general solo requiere una eficiencia de la columna de 5000 platos, para el análisis de homólogos solo 500, para sustancias que son difíciles de separar, se puede usar una columna de hasta 20000; generalmente es de aproximadamente 10. Una longitud de columna de ~30 cm puede satisfacer las necesidades de análisis de mezclas complejas.
La eficiencia de la columna se ve afectada por factores dentro y fuera de la columna. Para lograr la mejor eficiencia de la torre, además del pequeño volumen muerto fuera de la torre, debe haber una estructura de torre razonable (para reducir el volumen muerto fuera del lecho empacado tanto como sea posible) y tecnología de empaque. Incluso con la mejor tecnología de empaquetamiento, las condiciones de empaquetamiento siempre son diferentes en el centro de la columna y a lo largo de las paredes del tubo. La parte cercana a la pared de la tubería está suelta, propensa a canalizarse y el caudal es rápido, lo que afecta la distribución del agente de lavado y amplía la banda del espectro. Este es el efecto de pared del tubo. El área de la pared es aproximadamente 30 veces el espesor del diámetro del material hacia el interior de la pared. En los sistemas generales de cromatografía líquida, los efectos fuera de la columna tienen un impacto mucho mayor en la eficiencia de la columna que los efectos en la pared del tubo.
En cuarto lugar, detectores
Los detectores de cromatografía líquida de alto rendimiento se dividen en dos categorías: detectores generales y detectores especiales.
1. Un detector universal puede medir continuamente todos los cambios característicos del efluente de la columna cromatográfica, normalmente utilizando métodos de medición diferencial. Dichos detectores incluyen detectores de índice de refracción diferencial, detectores de constante dieléctrica, detectores de conductividad, etc. Los detectores universales tienen una amplia gama de aplicaciones, pero debido a que su respuesta a la fase móvil se ve fácilmente afectada por los cambios de temperatura, la fase móvil y los cambios de composición, tienen mucho ruido y deriva, baja sensibilidad y no pueden usarse para elución en gradiente.
2. Se utilizan detectores especiales para medir cambios en ciertas características de los componentes de la muestra separados. Estos detectores son sensibles a determinadas propiedades físicas o químicas de los componentes de la muestra que no están presentes en la fase móvil, o al menos no se expresan en las condiciones de funcionamiento. Dichos detectores incluyen detectores ultravioleta, detectores de fluorescencia, detectores radiactivos, etc.