La tecnología de integración mediada por enzimas de restricción (REMI) fue establecida por primera vez por Schiestl y Petes en 1991 cuando estudiaban Saccharomyces cerevisiae. Ha sido ampliamente utilizada en la transformación genética de hongos filamentosos. ADN plasmídico mediado por endonucleasas de restricción. Los estudios han encontrado que agregar enzimas de restricción a la mezcla de transformación puede mejorar significativamente la eficiencia de la transformación. Por lo tanto, se han utilizado enzimas de restricción para mejorar la eficiencia de las mutaciones de inserción fúngica y la inserción de una sola copia (Kahmann R et al., 1999; Riggle PJ et. otros, 1998). Puede mutar genes mediante la integración no homóloga de plásmidos de copia única, obteniendo así directamente marcadores genéticos, y puede realizar clonación de genes y análisis funcional mediante el rescate de plásmidos y otras tecnologías, lo que mejora en gran medida la eficiencia de la transformación.
8.1.6.1 Principios básicos de la integración mediada por enzimas de restricción (REMI)
La endonucleasa de restricción es una enzima endógena que puede reconocer y cortar secuencias específicas de ADN bicatenario en organismos. reconoce un sitio específico en el ADN y lo corta en ese sitio. Cuando las células se transforman con una mezcla de transformación que consiste en plásmido lineal digerido con la endonucleasa de restricción, la endonucleasa de restricción cortará el genoma de la célula receptora después de ingresar a ella, lo que hará que produzca extremos pegajosos que son complementarios al plásmido lineal, y luego, el plásmido extraño se inserta en el genoma mediante emparejamiento de bases. Si la inserción se produce dentro de un gen conocido, la función del gen puede cambiarse o perderse, es decir, se produce una mutación genética; si la inserción se produce dentro de un gen desconocido, los transformantes pueden detectarse mediante cambios en el fenotipo de las células receptoras; Combinado con el rescate de plásmidos, puede descubrir nuevos genes y realizar investigaciones en profundidad sobre los genes al mismo tiempo, cuando el plásmido extraño porta un gen de resistencia, la expresión de este gen de resistencia en las células receptoras se puede utilizar para detectarlo. Hijo, este proceso es el etiquetado genético.
8.1.6.2 Pasos generales para la integración y transformación de Trichoderma mediada por enzimas de restricción
REMI es un método para insertar aleatoriamente ADN plasmídico lineal en el receptor bajo la mediación de enzimas de restricción. La tecnología del genoma se utiliza para la investigación de mutaciones genéticas, marcadores genéticos y la búsqueda de nuevos genes. La transformación REMI generalmente incluye tres procesos, a saber, la preparación de protoplastos de Trichoderma (ver 8.1.1 para el proceso), la transformación mediada por enzimas de restricción y la selección de transformantes.
Transformación mediada por enzimas de restricción, en presencia de una endonucleasa de restricción, el plásmido linealizado digerido por la enzima de restricción se transforma en células mediante mediación de PEG o electroporación, y luego ingresa a la endonucleasa de restricción de la célula. corta partes específicas del genoma de la célula receptora para producir extremos pegajosos que son complementarios al plásmido lineal, que luego se conectan al plásmido extraño mediante emparejamiento de bases, integrando así el plásmido con el genoma. La linealización de plásmidos suele utilizar una endonucleasa de restricción que reconoce una secuencia de 6 bases, y la endonucleasa de restricción utilizada para la transformación mediada por PEG o por electroporación puede utilizar la misma endonucleasa de restricción utilizada para la linealización de plásmidos o utilizar una enzima homóloga que reconoce una secuencia de 4 bases. secuencia. Las endonucleasas de restricción que reconocen secuencias de 4 bases cortan el ADN genómico con más frecuencia que las homologasas que reconocen secuencias de 6 bases (estas secuencias que reconocen son, en promedio, cada 256 y 4096 bases en condiciones completamente aleatorias). base), por lo que los sitios donde el plásmido lineal se integra aleatoriamente en el genoma son más diversos y la probabilidad de que el gen adquiera mutaciones es mayor. Los plásmidos REMI contienen marcadores de selección para facilitar la selección de transformantes integrados con éxito. Los marcadores de detección dependen del plásmido utilizado. Se pueden utilizar marcadores auxotróficos, como el uso de células auxotróficas de uracilo. Después de la integración del plásmido, las células recuperan la capacidad de sintetizar uracilo; también se pueden utilizar plásmidos que portan genes de resistencia a fármacos, como los genes de higromiceto. zeocina y bleomicina (Zeocin), etc., no existen restricciones específicas al respecto.
En el cribado transformante, la inserción del plásmido en el genoma es aleatoria. El resultado de la inserción puede provocar la pérdida de la función de uno o algunos genes, lo que finalmente resulta en la pérdida de un determinado fenotipo de la célula. o la adquisición de un nuevo fenotipo. Por lo tanto, el método de detección de transformantes debe basarse en los cambios en el fenotipo celular a estudiar, es decir, se deben seleccionar métodos de detección apropiados para diferentes fenotipos.
Por ejemplo, Li Jishun et al. (2013) utilizaron el método REMI del gen exógeno de β-1,4-glucanasa para transformar Trichoderma viride, es decir, se utilizó la detección de resistencia a higromicina (HygB) combinada con la detección de actividad de glucanasa para obtener un biocontrol eficiente de Trichoderma. cepa diseñada L-10. Tang et al. (2009) utilizaron la integración mediada por endonucleasas de restricción (REMI) para construir y transformar Trichoderma atroviride (T.atroviride) T23 con la función de degradar pesticidas organofosforados (diclorvos), y obtuvieron una mayor capacidad para degradar diclorvos que el salvaje. Los transformantes mejoraron significativamente en base a T23.
8.1.6.3 Factores que afectan la transformación de integración mediada por enzimas de restricción
Las endonucleasas de restricción se usan dos veces en la transformación REMI, una para la linealización de plásmidos que requieren restricción. El otro paso es usar endonucleasa de restricción. y plásmido linealizado para transformar la célula receptora. Después de entrar en la célula receptora, la endonucleasa de restricción corta el genoma de la célula receptora. Entre ellas, la digestión de plásmidos es una tecnología convencional en ingeniería genética y tiene poco impacto en los resultados experimentales de REMI. Lo que tiene un mayor impacto son las enzimas de restricción involucradas en el proceso de transformación del ADN.
Los efectos de las enzimas de restricción en la tasa de conversión son los siguientes: ① La adición de enzimas de restricción aumentará la tasa de conversión, pero para diferentes microorganismos, el impacto de las enzimas de restricción en la tasa de conversión es diferente. Por ejemplo, bajo la acción de enzimas de restricción con actividad cortante, la frecuencia de inserción lineal del plásmido en el genoma de Dictyostelium es mayor que la de la levadura (Kuspa A et al., 1994). ② Dentro de un cierto rango, aumentar la dosis de endonucleasa de restricción puede aumentar la tasa de conversión, pero después de alcanzar el pico, disminuirá a medida que la dosis de enzima de restricción continúa aumentando (VanDijk R et al., 2001). ③ La actividad de escisión de la endonucleasa de restricción es un factor clave para la tasa de conversión. Por ejemplo, la BamHI utilizada en el experimento de Palaniyandi (1998) fue reemplazada por su proteína mutante BamHI-E77K. Aunque esta última también puede unirse al sitio BamHI. no puede escindir el ADN. La tasa es solo 1/1000 de BamHI, y REMI mediado por BamHI-E77K no ayuda a mejorar la tasa de conversión. Este resultado indica que la actividad de escisión de la enzima de restricción es necesaria para el REMI mediado por ella.
En términos generales, REMI no tiene requisitos especiales para los plásmidos. Por lo general, las enzimas de restricción utilizadas para la digestión y transformación de plásmidos deben tener los mismos extremos pegajosos. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que la inserción de plásmidos en el. aceptor El requisito previo para el genoma celular no es necesariamente que el plásmido sea completamente complementario al extremo generado después de que el genoma es cortado por una enzima de restricción, ni requiere que el extremo del plásmido sea un extremo pegajoso, pero debe ser linealizado El extremo del plásmido y el extremo generado por el genoma de la célula receptora. Al menos 2 bases en los extremos son iguales. Una explicación es que hay un sistema enzimático en la célula receptora que puede modificar apropiadamente el ADN. Este sistema enzimático elimina bases desapareadas, agrega bases catalizadas por la ADN ligasa y convierte los extremos romos mediante la exonucleasa en extremos pegajosos, etc. emparejar los extremos del genoma del plásmido y de la célula receptora. Sin embargo, la universalidad de sistemas enzimáticos similares en diferentes especies aún necesita más estudios.