El virus no está envuelto y tiene un diámetro de unos 75 nm. Tiene dos capas de cápsides simétricas icosaédricas y está compuesto por 32 capsómeros. El genoma está compuesto por 10 fragmentos de ARN bicatenario de diferentes tamaños, 3 grandes son L1~L3, 3 medianos son M4~M6 y 4 pequeños son S7~S10, que codifican 10 proteínas (VP1~VP7 y NS1, NS2, NS3/NS3A). La cápside interna está compuesta por dos proteínas principales, VP3 y VP7, y tres proteínas menores, VP1, VP4 y VP6, de las cuales VP6 se considera la helicasa del ARNbc viral [2]. La cápside externa está compuesta por dos proteínas, VP2 y VP5, que se eliminan cuando el virus atraviesa la membrana celular. Además, al menos tres proteínas no estructurales (NS1, NS2 y NS3/3A) están presentes en las células infectadas. El virus tiene nueve serotipos antigénicamente diferentes [3]. Aunque no se ha encontrado evidencia de variación intratípica en la naturaleza, en general se cree que existe cierta relación cruzada entre los serotipos, especialmente AHSV-1 y 2, AHSV-3 y 7, AHSV-5 y 8, y AHSV - entre 6 y 9. 2.1 Proteína VP2
La proteína VP2 está codificada por el gen L2 y es el principal antígeno específico del virus. Junto con el VP5, puede reaccionar con los anticuerpos neutralizantes del virus. Los ADNc de los genes L2 de los nueve serotipos de AHSV tienen las secuencias terminales típicas de circovirus 5′-GTT y TAC-3′. La masa molecular de la proteína codificada por el ORF del gen L2 es de aproximadamente 123 ku. El rango de variación de la secuencia de la proteína VP2 entre los nueve serotipos de AHSV es del 47,6% al 71,4%, que es la proteína con la mayor tasa de mutación de AHSV [4].
BentleyL et al. [5] utilizaron tecnología de presentación en fagos y una variedad de antisueros para identificar múltiples regiones antigénicas de la proteína AHSV-3VP2 recombinante. La mayoría de los sitios antigénicos y los sitios neutralizantes se encuentran en la región 252aa~488aa. Esta región no sólo difiere mucho entre los serotipos de virus, sino que también contiene principalmente aminoácidos hidrófilos, entre los que hay un epítopo lineal entre 369aa y 403aa [6]. Además, existe un mayor grado de identidad de secuencia interna en estos sitios antigénicos entre los serotipos virales con reacción cruzada y, por lo tanto, un mayor grado de homología entre los serotipos con reacción cruzada. Esto puede explicar la reactividad cruzada serológica entre serotipos.
La principal región antigénica de la proteína AHSV-4VP2 se encuentra en 199aa~414aa, mientras que 1aa~199aa (N-terminal) y 414aa~1060aa (C-terminal) no son inmunogénicas [7]. AHSV-4VP2 tiene 15 sitios antigénicos, divididos en dos grupos. Un grupo cubre el rango de 223aa a 400aa, incluidos 12 sitios antigénicos; el otro grupo cubre el rango de 568aa a 681aa, incluidos los otros 3 sitios antigénicos. La interacción entre VP5 y VP2 puede mostrar mejor el epítopo neutralizante de VP2, mejorando así la respuesta inmune.
Tres de los 15 sitios pueden inducir la producción de anticuerpos neutralizantes contra AHSV-4, y dos de los epítopos neutralizantes están ubicados en 321aa～339aa y 3
77aa～ respectivamente. [7]. La combinación de estos dos epítopos puede inducir una respuesta neutralizante más eficaz, pero el título de anticuerpos neutralizantes es relativamente bajo y es poco probable que se utilice para producir una vacuna sintética contra el AHSV. Este efecto puede deberse al cambio conformacional causado por la unión del anticuerpo a un epítopo, lo que facilita que otros anticuerpos se unan al otro epítopo. Otra razón puede ser que las reacciones de neutralización de estos dos sitios tengan efectos diferentes en la infección viral. (tales como adsorción virus-célula, translocación de virus, etc.) o constituyen una parte continua de un epítopo relativamente discontinuo. ASHV-9VP2 también tiene dos epítopos neutralizantes [5]. Al mismo tiempo, el BTV también tiene epítopos neutralizantes en la misma región, especialmente entre 328aa～335aa y entre 327aa～402aa. Por lo tanto, esta región puede ser un epítopo importante de los circovirus y un objetivo importante para los anticuerpos neutralizantes. Estos epítopos pueden estar en la superficie de la cápside viral, porque los epítopos neutralizantes generalmente están unidos a la superficie del virus para evitar que el virus se una a los receptores celulares y sea absorbido por las células. En particular, los dos epítopos neutralizantes se encuentran en las áreas más hidrofóbicas de la proteína y es muy probable que existan en la superficie del virus.
Se utilizó ELISA para probar [7] estos 15 sitios antigénicos y se encontró que los sitios antigénicos 8, 11 y 12 pueden unirse a anticuerpos, mientras que los sitios antigénicos 4, 6 y 15 pueden reaccionar con anticuerpos, pero no muestran actividad neutralizante. , especialmente el sitio 4, que aunque está en la superficie del virus, no induce la producción de anticuerpos neutralizantes. Otros sitios no reaccionaron con los anticuerpos, lo que indica que pueden estar enterrados dentro de la superficie del virus
La disposición interna del virus de la peste equina africana
o, aunque expuestos a la superficie del virus, en un Existe una conformación no reconocida por los anticuerpos.
2.2 Proteína VP5
La proteína VP5 está codificada por el gen M6. La secuencia conservada de la región no codificante del extremo 5′ del gen M6 es 5′-GUUAA-3′. Esta característica también se refleja en el BTV y el virus de la fiebre hemorrágica epizoótica (virus de la enfermedad epizoótica hemorrágica, EHDV) relacionado con el AHSV. La secuencia conservada de la región no codificante del extremo 3′ es 5′-ACAUAC-3′. La única excepción es AHSV-6, que tiene un nucleótido de citosina más en el extremo 3′, que es 5′-ACAUACC-. 3'. La masa molecular de la proteína codificada por el ORF del gen M6 es de aproximadamente 56,9 ku.
Las secuencias de aminoácidos VP5 de AHSV-6, AHSV-4, BTV-10 y EHDV-1 tienen alta identidad [8]. Tres regiones conservadas están ubicadas en el terminal N (1aa～123aa), el medio (192aa～273aa) y el terminal C (438aa～491aa). Estas regiones conservadas pueden interactuar con VP2 o VP7 para mantener la estabilidad de la estructura viral. Como proteína de cubierta, la proteína VP5 entre los serotipos de ASHV es muy similar. La VP5 está rodeada por la proteína VP2 y no puede neutralizar al huésped.
La proteína VP5 se divide en dos partes según el mapa de distribución de hidrofobicidad [8], la región N-terminal (1aa ~ 220aa) y la región C-terminal (aproximadamente 280aa ~ 505aa), con una alanina -glicina en el medio El área enriquecida (200aa ~ 270aa) sirve como bisagra para conectar las dos partes. El terminal N es helicoidal, mientras que el terminal C es una estructura esférica. Estas regiones desempeñan un papel en la estabilización de la estructura molecular dentro y entre las moléculas de las interacciones de proteínas. Una función importante de VP5 es interactuar con la proteína central más conservada y compensar los cambios en la proteína VP2. VP5 puede afectar indirectamente el serotipo del virus. Interactúa con VP2 y cambia la conformación de VP2, provocando así cambios en las características serológicas del virus.
VP5 puede inducir la producción de anticuerpos neutralizantes específicos del AHSV cuando se expresa solo o junto con VP2*** en células de insecto [9]. La región inmunodominante más obvia de la proteína VP5 se encuentra en los 330 residuos del extremo N. Hay dos regiones antigénicas, 151aa~200aa y 83aa~120aa, que se dividen en 8 sitios antigénicos. Los epítopos neutralizantes están en 85aa~92aa. 179aa. ~185aa. El primer epítopo neutralizante está altamente conservado entre diferentes circovirus y su anticuerpo monoclonal puede reconocer la proteína VP5 de BTV y EHDV.
2.3 Proteína VP7 y proteína VP3
La proteína VP7 y la proteína VP3 están codificadas por los genes S7 y L3 respectivamente, y son las principales proteínas de la cápside interna del virus. VP7 está altamente conservado entre los sueros de ASHV y es el antígeno específico del serogrupo de este virus [10]. MareeS et al. [11] utilizaron baculovirus recombinantes para clonar y expresar VP3 y VP7 de ASHV-9 en células de insecto. El nivel de expresión de VP7 fue alto y agregado en cristales únicos puede formar células tipo núcleo. en las células. La proteína AHSVVP7 forma cristales hexagonales planos en el citoplasma de las células infectadas, mientras que la VP7 expresada por baculovirus recombinante forma grandes cristales en forma de disco que son visibles al microscopio óptico.
Se observó bajo un microscopio electrónico que las partículas similares a núcleos formadas por las proteínas VP3 y VP7 de AHSV eran muy similares a las partículas de núcleo vacío de ASHV. A diferencia de los núcleos de ASHV, las partículas similares a núcleos tienen una región central oscura y una estructura de simetría icosaédrica típica. La capa exterior está rodeada por una capa de baja densidad electrónica, que tiene forma nodular y se extiende hacia afuera para formar partículas similares a núcleos con apariencia de vellosidades. El diámetro de las partículas con forma de núcleo de AHSV es de aproximadamente 72 nm, lo que es consistente con el diámetro de las partículas con forma de núcleo de BTV bajo el microscopio electrónico cuando se congelan, pero ligeramente más grande que el diámetro de las partículas con forma de núcleo de ASHV.
Utilice el anticuerpo monoclonal VP7 para reaccionar con partículas centrales similares al AHSV y modificarlas con anticuerpos. Bajo el microscopio electrónico, se puede ver que cada partícula está rodeada por una capa de sombra, que se forma por la interacción entre el anticuerpo monoclonal VP7 y VP7. caparazón.
Wade-Evans et al. estudiaron el efecto de la aplicación de AHSV-9VP7 como vacuna subunitaria. Los ratones fueron inmunizados con cristales de AHSV-9VP7 purificados y expuestos a AHSV-7. Se descubrió que VP7 tenía un efecto protector muy bueno en los ratones. El efecto protector producido por la vacunación con cristales de VP7 desnaturalizados o la expresión bacteriana procariótica de la proteína de fusión GST-VP7 fue más débil que el producido por la vacunación con cristales de VP7, lo que indica que la conformación de la proteína VP7 juega un papel importante en la función de la proteína. Los anticuerpos pasivos de ratones Balb/c inmunizados con AHSV-9VP7 no pudieron proteger a los ratones singénicos neonatales del desafío con AHSV-7, lo que sugiere que los anticuerpos pueden no ser el único factor protector. El virus tiene tres proteínas no estructurales, a saber, NS1, NS2 y NS3/NS3A. Codificado por los genes M5, S8 y S10 respectivamente.
Proteína 3.1 NS1
NS1 está altamente conservada entre el AHSV. Huismans y Els descubrieron en 1979 que existen microtúbulos específicos de virus únicos en el citoplasma de las células infectadas por circovirus
El proceso de recombinación del virus de la peste equina africana
La estructura consta de una composición NS1 . Hay una gran cantidad de estos microtúbulos en las células infectadas por el BTV, principalmente cerca o alrededor del núcleo. Estas estructuras morfológicas se adhieren a los filamentos intermedios del citoesqueleto. Su función puede ser la de transportar viriones maduros desde el cuerpo de inclusión viral a la membrana celular, donde luego el virus se libera por la acción de NS3, o como chaperonas moleculares para impedir el ensamblaje de proteínas menores (VP1, VP4 y VP6) antes de que se produzcan. están adecuadamente integrados con las partículas centrales del genoma viral.
NS1 de BTV y EHDV formaron microtúbulos después de expresarse en células de insectos utilizando baculovirus recombinantes. Los microtúbulos NS1 del BTV tienen un diámetro de 52,3 nm y están compuestos por hélices formadas por dímeros NS1, teniendo cada hélice 22 dímeros NS1. Maree y Huismans utilizaron baculovirus para expresar AHSV-6NS1 en células de insecto y utilizaron centrifugación de densidad en gradiente de sacarosa para analizar los microtúbulos de NS1. Se recogió una gran cantidad de fragmentos objetivo entre 200 S y 400 S, lo que indica que la proteína NS1 expresada existe en forma de partículas. o agregados en células infectadas. Aunque NS1 es el componente proteico predominante de estos fragmentos, también hay cantidades variables de otras proteínas determinadas, presumiblemente proteínas de baculovirus.
En el complejo NS1 de 200S a 400S, el diámetro promedio de los microtúbulos es de 23 nm ± 2 nm y la longitud más larga es de hasta 4 μm. Las diferentes longitudes pueden deberse a la fragmentación durante la purificación, lo que también puede ser la razón de los diferentes coeficientes de sedimentación de NS1 en los gradientes de sacarosa. Observada con un microscopio electrónico, la estructura fina de los microtúbulos del AHSV tiene una apariencia muy diferente a la de los microtúbulos del BTV y del EHDV. Los microtúbulos del AHSV tienen una estructura interna en forma de finas ondulaciones cruzadas en forma de malla. La región central de cada microtúbulo tiene un tramo alterno de densidad electrónica, mientras que la región de baja densidad representa la cavidad del microtúbulo. Los bordes de los microtúbulos son lisos y bien definidos, sin estructura de subunidad visible. No hay una apariencia segmentada o en forma de escalera en los microtúbulos más anchos del BTV (68 nm) y los microtúbulos del EHDV (52 nn). Las estructuras huecas en forma de anillos pueden representar secciones transversales de microtúbulos o segmentos muy cortos de microtúbulos grandes. El diámetro de estas estructuras es consistente con los microtúbulos de ASHV, con un diámetro de cavidad de aproximadamente 7 nm.
También hay una pequeña cantidad de microtúbulos específicos de baculovirus en el fragmento 200S~400S. Estos microtúbulos se diferencian claramente de los microtúbulos del AHSV en que son más grandes (40 nm de diámetro) y tienen una estructura fina diferente. Se pueden utilizar anticuerpos para identificar los microtúbulos del AHSV. Los microtubos se montaron sobre rejillas y se utilizó antisuero ASHV-6 para unirlos. Debido a la unión de los anticuerpos a NS1, se pueden ver sombras oscuras alrededor de los microtúbulos de NS1 bajo microscopía electrónica, mientras que no hay microtúbulos de baculovirus.
Los microtúbulos NS1 son inestables en concentraciones de CaCl2 de 0,2 mol/L y superiores, y sólo se pueden observar agregados de proteínas amorfas. En 1 mol/L de NaCl, sólo se puede ver una pequeña cantidad de microtúbulos, sus longitudes se reducen significativamente y hay muchas formas anulares. En tampón o entre pH 8,0 y 8,5, la morfología de los microtúbulos también se ve gravemente afectada, reduciéndose la longitud y desapareciendo la estructura fina. Los microtúbulos NS1 pueden tolerar un pH relativamente bajo, pero son más susceptibles a la degradación que los microtúbulos BTV en condiciones alcalinas.
Entre pH 5,0 y 5,5, la longitud de los microtúbulos disminuye y la superficie se vuelve desigual. A un pH de 5,0 o inferior, los microtúbulos se desnaturalizan y NS1 se agrega en agregados de proteínas amorfas.
3.2 Proteína NS3/NS3A
En comparación con los altos niveles de expresión de NS1 y NS2, las dos proteínas no estructurales más pequeñas, NS3 y NS3A, se sintetizan en pequeñas cantidades en las células infectadas. Estas dos proteínas relacionadas están codificadas por dos marcos de lectura abiertos superpuestos en el gen S10. La única diferencia entre ellas es que el extremo N de NS3 tiene 10 aminoácidos más que NS3A. NS3 está presente en la membrana de las células infectadas, especialmente en el sitio de liberación del AHSV en la membrana de las células Vero, lo que indica que NS3 está relacionado con la morfogénesis y la liberación del virus. La liberación viral puede preceder a los efectos citopáticos o a la lisis celular. AHSVNS3 expresado por baculovirus recombinante es una proteína asociada a la membrana y su localización es independiente de la presencia de partículas de AHSV. Además, cuando ASHVNS3 se expresa con baculovirus recombinante, sólo se sintetiza la proteína NS3 de 24ku y no se sintetiza NS3A.
La tasa de mutación de AHSV NS3 es superada solo por la proteína de la cápside externa VP2 entre las proteínas de AHSV [12]. La tasa de variación entre NS3 de ASHV-8 es del 27,6%, mientras que la tasa de variación entre NS3 de ASHV-4 es solo del 15%. La alta tasa de variación entre tipos se puede utilizar para distinguir subpoblaciones de virus del mismo tipo. Las diferencias en las secuencias de NS3 se pueden utilizar para distinguir cepas de campo y cepas de vacunas vivas atenuadas del mismo serotipo, y una tasa de mutación del 2,3% al 9,7% es suficiente para la diferenciación, especialmente cuando se combina con análisis filogenético.
El estudio de filogenia de ASHVNS3 dividió la proteína NS3 en tres linajes filogenéticos diferentes, denominados α, β y γ [13]. NS3 de AHSV-4, 5, 6, 8 y 9 pertenece a α, NS3 de ASHV-3, 7 y 8 pertenece a β y NS3 de ASHV-2 pertenece a γ. Aunque los tres grupos evolutivos de NS3 son obviamente diferentes, el grupo evolutivo al que pertenece un AHSVNS3 específico no está determinado únicamente por el serotipo del virus. Los reordenamientos genéticos del AHSV pueden explicar algunas de las mayores tasas de mutación. Los reordenamientos genéticos ocurren naturalmente en virus con genomas segmentados, como los ortomixovirus y los reovirus. La infección mixta de cebras y caballos con múltiples serotipos de ASHV puede causar recombinación de fragmentos S10 entre diferentes serotipos. La agrupación de serotipos del grupo fenotípico NS3 sugiere que los virus serotipo en el mismo grupo evolutivo NS3 tienen más probabilidades de sufrir un intercambio de genes S10.
La longitud de NS3 del AHSV-3 a 9 es de 217aa, mientras que la proteína NS3 del ASHV-2 es de 218aa. Las regiones conservadas de NS3 incluyen el codón de inicio de metionina de NS3A, una región rica en prolina (22aa～34aa), una región altamente conservada de 43aa～92aa y dos dominios hidrofóbicos que pueden formar hélices transmembrana (116aa～137aa y 154aa～170aa). )[14]. Estas características estructurales son comunes en la proteína NS3 de otros circovirus, incluido el BTV. Las dos regiones hidrofóbicas de BTVNS3 abarcan la membrana celular [15]. BTVNS3 también tiene sitios de glicosilación, y esta glicosilación puede prevenir la degradación de BTVNS3 [15]. Aparte de algunas propiedades conservadas, AHSVNS3 es significativamente diferente de BTVNS3. No hay evidencia de que la glicosilación de AHSV NS3 desempeñe un papel importante porque NS3 de algunos serotipos virales no tiene una supuesta secuencia de glicosilación. BTVNS3 se expresa en niveles altos en el sistema de expresión de baculovirus, mientras que AHSVNS3 se expresa en un nivel bajo y solo puede detectarse mediante inmunotransferencia o marcaje radiactivo.
La mayoría de los diferentes aminoácidos en AHSVNS3 existen en tres regiones, a saber, los 43 aminoácidos en el extremo N, los 15 aminoácidos entre 93aa y 153aa, y los 15 aminoácidos en el extremo C. . La zona de mayor variación (tasa de variación 82,4%) se ubica entre 136aa y 153aa. Las proteínas NS3 de todos los serotipos de ASHV, excepto AHSV-2, tienen una cisteína conservada en la posición 123aa. La cisteína de la proteína NS3 de ASHV-2 está en la posición 120aa y la segunda cisteína (164aa) está en la posición 120aa. Conservado entre todos los serotipos. Además, existe un motivo de N-tetradecilación altamente conservado (60aa～65aa o 59aa～64aa), que se encuentra en la región de anclaje de la proteína a la membrana celular. Al final del motivo de miristilación hay una región de aminoácidos cargados positivamente.
Ambas características se encuentran dentro de la región altamente conservada de 43aa a 92aa mencionada anteriormente. En comparación con las proteínas NS3 de otros circovirus, el motivo de N-miristilación en la región amino terminal de todas estas proteínas está altamente conservado. La miristilación por sí sola no proporciona suficiente energía para que la proteína se adhiera a la membrana bicapa de fosfolípidos. Las proteínas asociadas o de unión a membrana de otros virus, como la proteína Gag del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y la proteína Src del virus del sarcoma de Rous, contienen una región de aminoácidos básicos que estabiliza las interacciones de la membrana. Hay un motivo de dos partes similar en todas las proteínas NS3 de circovirus, que puede ser la señal de dirección a la membrana de las proteínas NS3.
Las dos regiones hidrofóbicas de ASHVNS3 están relacionadas con efectos citotóxicos. Las mutaciones en cualquiera de las regiones hidrofóbicas no alteran la dirección de las proteínas a las membranas, pero pueden desanclarlas a la membrana, impidiendo así su localización en la superficie celular y eliminando sus efectos citotóxicos. El efecto citotóxico de AHSVNS3 expresado por baculovirus en células de insectos (Spodopterafrugiperda, células Sf9) se logra cambiando la permeabilidad de la membrana celular.