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Microscopio
microscopio
Instrumento o dispositivo que magnifica objetos pequeños o partes diminutas de objetos a alta potencia para su observación. Es ampliamente utilizado en la producción industrial y agrícola y en la investigación científica. Los biólogos y médicos también utilizan frecuentemente microscopios en su negocio. Se dividen a grandes rasgos en microscopios ópticos y microscopios electrónicos.
El microscopio óptico es un microscopio que utiliza luz visible como fuente de luz. Un microscopio óptico ordinario se puede dividir estructuralmente en dos partes: sistema óptico y dispositivo mecánico. El sistema óptico incluye principalmente oculares, lentes objetivos, condensadores, diafragmas y fuentes de luz. El dispositivo mecánico incluye principalmente el cilindro de la lente, la columna del espejo, la platina, el soporte de la lente, el tornillo de ajuste del espesor y otras partes (Figura 1 [microscopio óptico]). Su principio óptico básico se muestra en la Figura 2 [Diagrama del modelo del principio de imágenes del microscopio óptico]. La pequeña lente convexa en el lado izquierdo de la figura representa un grupo de lentes con una distancia focal corta, llamada lente objetivo. La gran lente convexa de la derecha representa un grupo de lentes con una distancia focal larga, llamado ocular. El objeto que se observa (AB) se coloca ligeramente fuera del punto focal (f) de la lente del objetivo. Después de que la luz del objeto pasa a través de la lente del objetivo, forma una imagen real ampliada invertida (BA) ligeramente dentro del foco (f) del ocular. Los ojos del observador amplían aún más la imagen real (BA) hasta convertirla en una imagen virtual invertida (BA) a través del ocular.
El ocular está situado encima del tubo del microscopio y generalmente consta de dos lentes convexas. Además de ampliar aún más la imagen real formada por la lente del objetivo, también limita el campo de visión observado por el ojo. Según el aumento, existen tres oculares de uso habitual: 5x, 10x y 15x.
La lente objetivo generalmente se encuentra debajo del tubo del microscopio, cerca del objeto que se está observando. Consta de 8 a 10 lentes. Su función es ampliar (crear una imagen real ampliada del objeto), asegurar la calidad de la imagen y mejorar la resolución. Los objetivos de uso común se pueden dividir en objetivos de bajo aumento (4×), aumento medio (10× o 20×), alto aumento (40×) y objetivos de inmersión en aceite (100×) según su aumento. Se montan múltiples lentes de objetivo en el cambiador de lentes al mismo tiempo. Puede girar el plato giratorio para seleccionar lentes de objetivo con diferentes aumentos según sea necesario.
El aumento de un microscopio es el aumento del ocular multiplicado por el aumento de la lente del objetivo. Si el ocular es de 10 veces y la lente del objetivo es de 40 veces, el aumento es de 40×10 veces (aumento de 400 veces). Un microscopio excelente puede aumentar 2000 veces y resolver dos puntos separados por 1 × 10 cm.
Cuando la luz blanca pasa a través de una lente convexa, el índice de refracción de la luz de longitud de onda más corta (azul-violeta) es mayor que el de la luz de longitud de onda más larga (rojo-naranja). Por tanto, aparecen varios espectros de color. alrededor de la periferia de la imagen durante la toma de imágenes y hay un brillo azul o rojo; este defecto de color se llama aberración cromática. Debido a que la luz entra (y sale) de las distintas partes de la lente en diferentes ángulos, la luz que pasa por la periferia de la lente se refracta en un ángulo mayor que la luz que pasa por el centro de la lente. Por lo tanto, aparece una imagen borrosa y distorsionada alrededor de la imagen durante la toma de imágenes. Este defecto de curvatura de la superficie de la imagen se llama aberración esférica. Una serie de grupos de lentes convexos y cóncavos con diferentes formas, estructuras y distancias trabajan juntos para corregir la aberración cromática y la aberración esférica en la mayor medida, formando una imagen brillante, clara y precisa. Es por eso que el ocular o lente objetivo está compuesto cada uno de un conjunto de lentes. Este tipo de lente se llama plan acromático.
Cuando la luz se proyecta desde un medio (como el aire) a otro medio más denso (como el vidrio), se curvará hacia lo "normal" (una línea perpendicular a la interfaz del medio), como como la línea BOA en la Figura 3 [Situación cuando la luz pasa a través de la lente del objetivo]. Cuando la luz ingresa a un medio no denso (aire) desde un medio denso (vidrio), se desviará de lo "normal". Por ejemplo, la línea AOB (Figura 3a) también se desviará cuando la luz pase a través del vidrio del condensador ( índice de refracción 1,51) y entra en el aire. Se refracta hacia afuera, por lo que la cantidad de luz que ingresa a la lente del objetivo se reduce considerablemente y la resolución de la imagen también se reduce. Cuando se utiliza un objetivo de 100x, si se llena aceite entre el objetivo y el cubreobjetos (el índice de refracción también es 1,51) para aislar el aire, la luz puede entrar en el objetivo casi sin refracción, lo que aumenta el brillo y la resolución. de la imagen. Este tipo de objetivo se denomina objetivo de inmersión en aceite (Figura 3b).
El condensador está ubicado debajo de la platina del microscopio. Puede condensar la luz de la fuente de luz y concentrarla en la muestra para que la muestra se ilumine uniformemente con una intensidad de luz moderada. El extremo inferior del condensador está equipado con un diafragma de apertura (apertura) para controlar el espesor del haz de luz.
La fuente de iluminación de un microscopio óptico común se encuentra debajo del condensador. Es una bombilla de luz fuerte especial con iluminación uniforme y está equipada con una resistencia variable que puede cambiar la intensidad de la luz.
Dado que la fuente de luz de los microscopios ópticos comunes se transmite hacia arriba desde la parte inferior del cuerpo del espejo, pasa a través del condensador y la lente objetivo y llega al ocular, en la investigación médica y biológica, la muestra a ser Las muestras observadas deben cortarse en trozos que puedan transmitir la luz, una sección delgada de unos 6 m de espesor, y deben teñirse para mostrar diferentes tejidos, células y otras estructuras finas. Todo el proceso de procesamiento se denomina tecnología convencional de preparación de tejidos, e incluye la selección de los materiales de tejido apropiados, su fijación en una solución de formaldehído (formalina), su deshidratación con alcohol paso a paso, su inclusión en parafina, el uso de un microtomo para cortar el tejido en rodajas finas y montándolos en portaobjetos de vidrio. Después de teñir con tinte de hematoxilina-eosina, los portaobjetos de tejido finalmente se montaron en pegamento de resina óptica. Los portaobjetos de tejido preparados se pueden almacenar durante mucho tiempo.
Los oculares y las lentes objetivas del microscopio se instalan en ambos extremos del cilindro de la lente y su distancia es fija. Coloque el portaobjetos de tejido en la platina y gire el tornillo de ajuste aproximado para acercar la platina a la lente del objetivo. La sección de tejido ingresa al primer plano focal de la lente del objetivo y la imagen del tejido en la muestra se puede ver en el ocular. Luego utilice el tornillo de ajuste fino para aclarar la imagen en el ocular para su observación. Al cambiar el aumento, se debe reemplazar el ocular o la lente del objetivo.
Existen los siguientes 12 tipos de microscopios ópticos comúnmente utilizados en medicina y biología:
El microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador de campo oscuro debajo de la platina del microscopio óptico ordinario ( Figura 4), de La luz de la fuente de abajo es reflejada por el condensador parabólico, creando un haz intenso que atraviesa el campo de visión del microscopio sin entrar en la lente del objetivo. Por lo tanto, el campo de visión es oscuro y las partículas con un diámetro superior a 0,3 m en el campo de visión dispersan la luz y su tamaño y forma se pueden ver claramente. Incluso se pueden ver partículas de unos pocos nanómetros invisibles en la microscopía de campo brillante ordinaria. Por lo tanto, se utiliza a menudo en biopsias de determinadas bacterias y células.
Un microscopio sólido consta de oculares binoculares y lentes objetivos. Ampliación de 7 a 80 veces. Utilice la luz del microscopio lateral superior o inferior para la iluminación. En el ocular se forma una imagen real ampliada verticalmente, y se puede observar la forma tridimensional, el color y la microestructura de la superficie de objetos no procesados, se pueden realizar operaciones de microanatomía y también se pueden observar secciones de tejido de organismos biológicos.
Bajo el microscopio de fluorescencia, bajo la irradiación de ondas de luz de longitud de onda corta (luz ultravioleta o luz azul púrpura, longitud de onda 250 ~ 400 nm), ciertas sustancias absorben energía luminosa, se excitan y liberan una onda de luz más larga con energía degradada (luz azul, verde, amarilla o roja, longitud de onda 400 ~ 800 nm), esta luz se llama fluorescencia. Una determinada sustancia puede emitir fluorescencia bajo irradiación de luz de onda corta. Por ejemplo, la mayoría de los lípidos y proteínas de los tejidos pueden emitir una fluorescencia de color azul claro después de la irradiación, lo que se denomina autofluorescencia. Sin embargo, la mayoría de las sustancias deben teñirse con tintes fluorescentes (como naranja de acridina, isotiocianato de fluoresceína, etc.) antes de que puedan emitir fluorescencia bajo irradiación de luz de onda corta. La fuente de luz del microscopio de fluorescencia es una lámpara de mercurio de alta presión. La luz ultravioleta emitida se filtra mediante un filtro de excitación (este filtro puede pasar la luz de excitación adecuada para las sustancias fluorescentes en la muestra) y luego se dirige al espejo dicroico de Purham. La luz de excitación se refleja hacia abajo y se proyecta a través de la lente del objetivo sobre la muestra teñida con el tinte fluorescente. El tinte se excita y libera fluorescencia, que se puede observar a través del objetivo, el espejo dicroico y el ocular. Se coloca un filtro de barrera debajo del ocular (que solo permite el paso de la fluorescencia de longitudes de onda específicas) para proteger los ojos y reducir la oscuridad del campo de visión (Figura 4 [Principio óptico del microscopio de fluorescencia]). La microscopía de fluorescencia se caracteriza por una alta sensibilidad. La tinción fluorescente de baja concentración en campo oscuro puede mostrar la presencia de muestras en la muestra y su contraste es aproximadamente 100 veces mayor que el de la microscopía de luz visible. En la década de 1930, la tinción fluorescente se utilizó para observar y estudiar la morfología de bacterias, mohos y otros microorganismos, células, fibras, etc. Por ejemplo, la tinción fluorescente de bacterias acidorresistentes puede ayudar a encontrar Mycobacterium tuberculosis en el esputo.
En la década de 1940, se creó la tecnología de marcado de proteínas con tintes fluorescentes. Esta tecnología ahora se usa ampliamente en técnicas convencionales de tinción de anticuerpos por inmunofluorescencia para detectar y localizar virus, bacterias, mohos, protozoos, parásitos y antígenos de tejidos animales y humanos. utilizarse para explorar las causas y la patogénesis, como la clasificación y el diagnóstico de enfermedades glomerulares, la relación entre el virus del papiloma y el cáncer de cuello uterino, etc. Se utiliza cada vez más en investigaciones médicas experimentales y diagnóstico de enfermedades.
Microscopio polarizador Cuando la luz emitida por la fuente de luz pasa a través del aire y el vidrio ordinario, vibra con la misma amplitud en todas las direcciones en el plano perpendicular a la luz y pasa rápidamente hacia adelante. Este es el principio ondulatorio. de luz. El aire y el vidrio ordinario son cuerpos isotrópicos, también conocidos como cuerpos refractivos simples. Si la luz de esta fuente de luz pasa a través de un cuerpo anisotrópico (también llamado cuerpo birrefringente), un haz de luz se dividirá en dos haces de luz, cada uno de los cuales tiene un solo plano de vibración y las direcciones de vibración son perpendiculares entre sí. Los dos haces de luz tienen diferentes direcciones de vibración, velocidades, índices de refracción y longitudes de onda. De esta forma, la luz con un solo plano de vibración se denomina luz polarizada. Los microscopios polarizadores están diseñados para aprovechar este fenómeno. En un microscopio polarizador, se inserta una lente analizadora entre la lente objetivo y el ocular, se instala una lente polarizadora entre la fuente de luz y el condensador, y la platina circular puede girar 360° (Figura 5 [Principio óptico del microscopio polarizador]) . Cuando las lentes polarizadoras y de análisis están en la posición de análisis ortogonal, el campo de visión se vuelve completamente negro. Coloque el objeto a inspeccionar en la platina del microscopio. Si el objeto a inspeccionar es un único objeto refractivo, gire el escenario y el campo de visión siempre estará oscuro. Si la platina del microscopio se gira una vez y el objeto bajo inspección tiene cuatro brillos y cuatro oscuridad en el campo de visión, significa que el objeto bajo inspección es un objeto birrefringente. Muchas sustancias cristalinas (como cristales de urato en nódulos de gota, cálculos urinarios, cálculos biliares, etc.), fibras elásticas, fibras de colágeno, cromosomas y fibrillas de amiloide en los tejidos humanos son birrefringentes y pueden absorber luz polarizada. Examen microscópico, análisis cualitativo y cuantitativo.
El microscopio de fases también se llama microscopio de contraste de fases o microscopio de contraste de fases. La razón por la cual los microscopios ópticos comunes no pueden ver imágenes de tejidos, células, bacterias, virus y otros organismos vivos sin teñir es porque la diferencia (contraste) en el cambio de luz que pasa a través de la muestra es muy pequeña. Después de teñir la muestra, la amplitud (brillo) y la longitud de onda (color) cambian, lo que afecta el contraste para obtener la imagen. Sin embargo, el teñido puede provocar la deformación de la muestra y también la muerte de organismos vivos. Para observar tejidos frescos, células u otros objetos vivos diminutos sin teñir, se debe utilizar un microscopio de fase. El principio de la microscopía de fase es que dos ondas de luz interfieren entre sí debido a la diferencia de fase, lo que produce cambios en la intensidad y el contraste de las ondas de luz para formar una imagen visible. La luz emitida por una fuente de luz puntual puede aparecer como un patrón de onda sinusoidal (Figura 6a [Microscopio de fase]). La distancia entre las dos crestas de onda es la longitud de onda y la amplitud de la onda representa el brillo de la luz (gran amplitud, alto brillo). Imaginemos dos ondas de luz emitidas por la misma fuente de luz que atraviesan el aire y algún medio transparente al mismo tiempo. Al pasar a través de un cierto espesor de un medio transparente, la velocidad de la onda de luz disminuirá, pero el brillo de la luz no cambiará. Después de pasar a través del medio transparente, la onda de luz va por detrás de la longitud de onda de la otra onda de luz que ha estado viajando por el aire, por lo que las dos ondas de luz experimentan un cambio de fase (diferencia de fase). Pero el ojo humano no puede distinguir la diferencia de fase entre estos dos rayos paralelos. Si estas dos ondas de luz inciden en el mismo punto de la pantalla de luz, y una onda de luz es media longitud de onda más lenta que la otra, es decir, las dos ondas de luz interfieren entre sí y se cancelan debido a fases opuestas, y la luz desaparece, o las amplitudes relativas interactúan entre sí y la luz se debilita. Si una onda de luz se retrasa una longitud de onda, pero las dos ondas de luz están en la misma fase, la luz mejorará debido a la superposición de las ondas.
La estructura básica de un microscopio de fases es la misma que la de un microscopio óptico común y corriente. La diferencia es: ① Por encima de la lente objetivo, se instala una placa de fase en forma de disco en el segundo plano focal de la lente objetivo (Figura 6b [Microscopio de fase]). ② Debajo del condensador, se instala un haz en forma de anillo en el primer plano focal del condensador y se talla una hendidura estrecha en el haz para pasar a través de la luz intensa en forma de anillo (Figura 6c [Microscopio de fase]). Como se muestra en la Figura 6d, la luz emitida desde el punto A del haz anular se convierte en luz paralela después de pasar a través del condensador. Cuando la luz pasa a través de la muestra en el escenario, se interfiere debido al diferente índice de refracción de cada partícula en la muestra (como el punto b) y se difracta, que se divide en ondas no desviadas (líneas continuas) y ondas desviadas (líneas discontinuas). pauta).
La onda no desviada es enfocada por la lente del objetivo y representada en el punto A de la placa de fase, luego pasa a través de la placa de fase y se distribuye uniformemente en el plano de la imagen de la muestra para convertirse en el fondo. Después de pasar a través de la lente objetivo, la onda desviada pasa a través de la placa de fase alrededor del punto A y también se enfoca en el plano de la imagen B. En otras palabras, la onda no desviada y la onda desviada pasan por diferentes partes de la placa de fase. Se aplican diferentes recubrimientos en diferentes áreas de la placa de fase, lo que puede cambiar la velocidad y el brillo de la onda no desviada o de la onda desviada respectivamente. Como resultado, las dos ondas de luz tienen una diferencia de fase, que es media longitud de onda o una longitud de onda. Se reflejan en la imagen. La onda combinada del avión crea un contraste entre la luz y la oscuridad, y se puede ver cada detalle dentro de la muestra.
En resumen, la microscopía de fase utiliza la diferencia en el índice de refracción de las partículas de la muestra o el espesor de las partículas para generar la diferencia de fase de la luz, de modo que se puedan ver muestras frescas sin mancharse. y puede observar los componentes internos de las células vivas. Las estructuras finas, como las mitocondrias y los cromosomas, también se pueden utilizar para estudiar organismos vivos más pequeños, como mohos, bacterias, virus, etc., para observar la morfología, cantidad, actividad, división y reproducción de las muestras. otros comportamientos biológicos, y medirlos y compararlos.
Microscopio invertido La lente objetivo de un microscopio común se dirige hacia abajo, hacia la muestra. La lente objetivo de un microscopio invertido está en una posición vertical hacia arriba, por lo que el eje longitudinal del ocular y el tubo de la lente forman un ángulo de 45 grados con respecto al eje longitudinal de la lente objetivo. El escenario tiene un área grande, encima de la lente del objetivo, y hay un condensador de larga distancia focal y una fuente de iluminación encima del escenario. La lente objetivo y el condensador pueden equiparse con accesorios para microscopios de fase. La tasa de aumento es de 16 a 80 veces. Los frascos de cultivo de tejidos y los platos de cultivo se pueden colocar directamente en el escenario para observar la morfología, cantidad y dinámica de muestras frescas, organismos vivos y células sin teñir. Se pueden observar los resultados de las placas de inmunorreacción y microbioquímica de múltiples pocillos. El microscopio invertido se puede reemplazar con una lente óptica de campo brillante ordinaria y se puede equipar con luz polarizada, diferencia de interferencia diferencial y accesorios de fluorescencia para la observación.
La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) también se llama microscopio de interferencia o interferencia. Puede ver y medir pequeños cambios de fase, similar a un microscopio de fase, de modo que las muestras incoloras y transparentes puedan tener cambios de luz, sombra y color, mejorando así el contraste. La estructura básica de un microscopio óptico ordinario está equipada con componentes de polarización e interferencia, así como con una platina giratoria de 360°, que utiliza el principio de interferencia de la luz polarizada. Como se muestra en la Figura 7 [Principio óptico del microscopio de diferencia de interferencia diferencial], se colocan una lente polarizadora y un prisma de división del haz sobre la fuente de luz. Después de que la luz polarizada linealmente que sale de la lente polarizadora pasa a través del prisma divisor del haz, se divide en dos luces polarizadas linealmente que vibran perpendicularmente entre sí. Los dos rayos son refractados por el condensador y luego dirigidos hacia la muestra. Debido al diferente índice de refracción de cada partícula en la muestra, la fase de algunas ondas de luz cambia y se desplaza lateralmente debido a la interferencia. Después de pasar a través de la lente del objetivo, los dos rayos de luz son fusionados por el segundo conjunto de prismas divisores del haz y el analizador los interfiere. Cada punto de la imagen final es una imagen mixta compuesta por dos imágenes diferentes superpuestas del mismo punto del objeto, de modo que pueda identificarse a simple vista.
La microscopía de contraste de interferencia diferencial también puede observar objetos incoloros y transparentes invisibles en un campo brillante ordinario. Puede observar células, bacterias y otros organismos vivos, y la imagen es tridimensional, que es más detallada y detallada que. La imagen del microscopio de fase es más realista. Puede utilizarse para investigaciones más detalladas sobre diversas partes de las células vivas. Si se utiliza luz blanca para la iluminación, aparecen diferentes fases en varios colores. Cuando se gira el escenario, los colores cambiarán. La iluminación monocromática produce un contraste entre la luz y la oscuridad, y varios componentes presentan diferentes contrastes. La microscopía de contraste de interferencia diferencial también se puede utilizar como una balanza óptica ultramicro de alta precisión para estimar la masa exacta de objetos secos tan pequeños como 1 × gramo. Cuando la concentración de materia sólida contenida en una célula aumenta en un uno por ciento, su índice de refracción aumenta en 0,0018. El índice de refracción de cada componente de fase de la celda se puede estimar en función de la diferencia entre él y el área relevante (área de suspensión), de modo que se puede calcular aún más el peso seco de ciertos componentes en una celda.
Microscopio fotográfico Los microscopios modernos de alta calidad pueden equiparse con diversos accesorios para fotomicrografía, que pueden preservar los datos científicos de manera oportuna y completa. Los microscopios utilizados para fotografía requieren estructuras precisas de sistemas y componentes ópticos, y cuerpos de espejo fuertes y estables.
Está equipado con un tubo trinocular, de los cuales dos tubos oculares para observación en ángulo de 45° y un tubo vertical central están equipados con una cámara 135, accesorios de medición de exposición, oculares fotográficos y lentes de visor, que pueden usarse para encuadrar y enfocar. El condensador puede ajustar el centro del campo de visión y está equipado con un diafragma de apertura para iluminar uniformemente el campo de visión. La base de la lente tiene un diafragma de campo ajustable, un voltímetro y una luz indicadora de voltaje. Hay una resistencia variable para ajustar el brillo de la iluminación. La fuente de iluminación es una bombilla halógena de 6 a 12 voltios y de 40 a 100 vatios. El dispositivo de microfotografía de exposición automática de la década de 1980 tenía varias funciones, como el enrollado automático de la película, la medición automática, el control automático de la exposición, la medición y el ajuste de la temperatura del color y la compensación por fallas en la ley de reciprocidad. Todos estaban controlados automáticamente por computadoras electrónicas y podían realizar trabajos en negro. y películas fotosensibles en blanco, Proyecciones de negativos en color y diapositivas en color.
El tubo de lente vertical central se puede instalar con un dispositivo de cámara de televisión o una cámara de cine de 16 mm y un dispositivo de control, que se puede utilizar para congelación de fotogramas cronometrada o grabación fotográfica continua de especímenes vivos.
El sistema de microscopio fotográfico de investigación universal integra varias funciones como campo brillante ordinario, campo oscuro, luz polarizada, fluorescencia, fase, interferencia diferencial y fotomicrografía en un solo sistema. También hay funciones como el enfoque automático controlado por computadora para fotografías con bajo aumento, la conversión automática de lentes de objetivo, la adaptación automática de condensadores y el ajuste automático del brillo de la fuente de luz. En el fuselaje están instaladas dos cámaras 135 y una cámara grande de 4×5 pulgadas. Además, se pueden instalar cámaras de televisión y dispositivos de fotografía de película de 16 mm, y también tiene muchas funciones como enrollado automático de película, medición automática, control automático de exposición, medición y ajuste de la temperatura del color, compensación de falla recíproca, etc.
Microscopía Electrónica El poder de resolución de los microscopios ópticos está limitado por la longitud de onda de las ondas luminosas utilizadas. Los objetos más pequeños que la longitud de onda de la luz no se pueden visualizar debido a la difracción. El límite de resolución de los microscopios ópticos más avanzados es de unos 200 nm (2000). Para superar este límite, se pueden utilizar rayos de electrones en lugar de ondas de luz. Cuando las partículas de electrones se mueven a gran velocidad, su comportamiento es similar al proceso de propagación de las ondas de luz. La longitud de onda de los electrones en movimiento depende de su velocidad. Cuando la presión alcanza los 500.000 voltios, su longitud de onda es de 0,001 nm (0,01), es decir, la longitud de onda de los rayos de electrones es aproximadamente una cienmilésima parte de la luz visible y el límite de su resolución es. alrededor de 4. Su aumento es muchos niveles mayor que el del microscopio óptico más avanzado. Los microscopios que utilizan rayos de electrones como fuente de luz de electrones se denominan microscopios electrónicos. La resolución de los microscopios electrónicos utilizados en la medicina y la biología modernas es de 5 a 10, es decir, el aumento es de 100.000 a 200.000 veces.
Debido al diferente espesor de las muestras, se pueden observar con un microscopio electrónico de transmisión muestras muy finas cortadas mediante ultramicrótomo. Las muestras que no se pueden cortar muy finas se pueden observar con un microscopio electrónico de barrido.
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) es el microscopio electrónico más utilizado y consta de un cañón de electrones, un sistema de lentes electromagnéticos, una pantalla (o cámara) fluorescente, un tubo para lentes, un soporte para lentes, un Un transformador, un dispositivo estabilizador de voltaje, un cable de alto voltaje y una bomba de vacío. El sistema, la consola y otros componentes conforman el cañón de electrones, que equivale a la fuente de luz de un microscopio óptico, suministrando y acelerando el haz de electrones emitido. del filamento de tungsteno caliente del cátodo. El voltaje utilizado en los microscopios electrónicos es generalmente de 200.000 a 300.000 voltios, lo que es suficiente para hacer que los electrones del cañón de electrones salgan volando a gran velocidad. Los electrones pasan a través de la lente del condensador y llegan a la muestra. Debido a que la muestra es muy delgada, los electrones de alta velocidad pueden atravesarla y debido a que el grosor o la densidad de cada parte de la muestra es diferente, los electrones que pasan son cada vez más densos. . El voltaje debe ser estrictamente estable para que la imagen sea estable, y pequeños cambios de voltaje pueden causar interferencias graves. El brillo de la imagen se puede controlar mediante un cañón de electrones.
El grupo de lentes electromagnéticas es equivalente al sistema de condensador, lente objetivo y ocular en el espejo luminoso. Cuando el haz de electrones pasa por el centro del campo magnético circular de cada lente electromagnética, puede converger para producir una imagen. El sistema de lentes del microscopio electrónico consta de 4 grupos de lentes electromagnéticas, que incluyen lentes de condensador, lentes de objetivo, lentes intermedias y lentes de proyección (ocular). El flujo de corriente a través de la lente del condensador se puede variar para enfocar el haz de electrones en la muestra y proporcionar "iluminación". El objetivo está enfocado cerca de la muestra. Mediante el aumento de tres etapas de la lente objetivo, el espejo intermedio y la lente de proyección, se puede obtener una imagen de gran aumento a una cierta distancia y la imagen final se proyecta en la pantalla fluorescente. Se puede utilizar una película en blanco y negro en lugar de la pantalla fluorescente para hacer una placa fotográfica. Cambiar la cantidad de corriente en la bobina electromagnética hace que la lente electromagnética se enfoque y produzca diferentes aumentos (Figura 8 [Microscopio electrónico de transmisión]).
Para minimizar la posibilidad de dispersión causada por la colisión de electrones con moléculas de aire en el microscopio electrónico, el grado de vacío en el tubo de la lente es muy alto, por lo que el tubo de la lente sellado está conectado a un vacío. bomba. Debido a que la muestra debe colocarse en un tubo de vacío, no se puede examinar el material vivo.
El microscopio óptico utiliza principalmente ondas de luz visible como fuente de luz. Después de teñir la muestra, la longitud de onda (color) y la amplitud (brillo) de la luz cambian, lo que afecta el contraste para obtener la imagen. . La microscopía electrónica utiliza rayos electrónicos. El poder de penetración de los haces de electrones no es fuerte, por lo que las muestras para microscopía deben cortarse en secciones tan delgadas como de 50 a 100 nm de espesor. Los pasos de preparación de las secciones de microscopía electrónica son similares a los de las secciones de microscopía óptica, que también constan de procedimientos como fijación, deshidratación, inclusión, corte y tinción: primero, se toma una muestra de la muestra a observar, con un volumen de alrededor de 1. Después de una doble fijación con glutaraldehído y tetróxido de osmio, se deshidrataron con alcohol (o acetona) paso a paso, se embebieron en resina epoxi y se seccionaron con un ultramicrótomo. La formación de una imagen en un microscopio electrónico es el resultado de la dispersión diferente de los electrones del haz de electrones por distintas partes del trozo de tejido. Los lugares densos (detalles) de la muestra se dispersan fuertemente. Se pueden usar varias sales de metales pesados para teñir y aumentar el contraste, y comúnmente se usan contratinciones de acetato de uranilo y citrato de plomo. Dado que el haz de electrones no puede atravesar el vidrio, las láminas teñidas se colocaron sobre una pequeña rejilla de cobre para su observación con microscopio electrónico.
La tecnología de grabado por congelación es una nueva tecnología de procesamiento de muestras de microscopio electrónico inventada en la década de 1950 y posteriormente mejorada. El principio fundamental es colocar muestras biológicas que se congelan rápidamente a temperaturas ultrabajas (-200 °C) en nitrógeno líquido en un dispositivo de congelación al vacío y romperlas, exponiendo así las estructuras internas de los orgánulos en diferentes partes y mostrando tridimensionales. estructuras de diferentes alturas. Rocíe una capa de película de carbono platino (réplica) sobre la superficie de fractura recién formada. La muestra recubierta se digiere en una solución corrosiva ácida fuerte o alcalina fuerte. La película réplica se hace flotar, se recupera, se limpia y se coloca sobre una pequeña rejilla de cobre para observación y fotografía con microscopio electrónico. La tecnología de grabado por congelación juega un papel importante en el estudio de las estructuras de biopelículas celulares (como membranas celulares, mitocondrias, retículo endoplásmico, etc.).
Microscopio electrónico de barrido (SEM) Para producir una imagen óptica electrónica sobre la superficie más gruesa de la muestra, se utiliza el método de barrido electrónico (Figura 9 [Diagrama esquemático de la estructura del microscopio electrónico de barrido]). Los principios estructurales del cañón de electrones y la lente electromagnética del microscopio electrónico de barrido son similares a los del microscopio electrónico de transmisión. Una gran cantidad de electrones generados por el cañón de electrones convergen continuamente mediante tres conjuntos de lentes electromagnéticas para formar un rayo de electrones muy delgado (sonda de electrones). Este haz de electrones escanea secuencialmente la superficie de la muestra bajo la acción de dos pares de bobinas de desviación en el cilindro del microscopio electrónico. Dado que la corriente del generador de ondas en dientes de sierra alimenta al mismo tiempo dos juegos de bobinas de desviación en el tubo del microscopio electrónico y en el tubo de visualización, los rayos electrónicos de la pantalla generan un escaneo sincrónico en la pantalla fluorescente. Los electrones emitidos por la muestra son recolectados por el detector, amplificados por el amplificador de video y controlan el brillo del tubo de visualización. Por lo tanto, el brillo escaneado en la pantalla fluorescente está controlado por la cantidad de electrones generados en los puntos correspondientes de la superficie de la muestra, por lo que se muestra una imagen de gran aumento de la muestra en la pantalla fluorescente. El factor de ampliación se puede controlar controlando las corrientes de los dos conjuntos de bobinas de desviación. Además, se instala un tubo de visualización de escaneo fotográfico sincronizado idéntico.
En la preparación de muestras de microscopio electrónico de barrido, es necesario deshidratar y básicamente mantener su estado natural, por lo que se utiliza la tecnología crítica de liofilización de las muestras: se limpia la superficie del tejido y se Doble fijación con glutaraldehído y tetróxido de osmio. Deshidratación gradual con acetona. Dado que es muy fácil reemplazar el acetato de amilo con Co licuado, primero se reemplazó la acetona con acetato de amilo en gradiente. Luego, la muestra se coloca en una cámara sellada resistente a la presión y se introduce Co líquido para sumergir la muestra. Pronto Co reemplazó completamente el acetato de amilo en la muestra y descargó este último de la cámara de presión. Al mismo tiempo, la transformación mutua entre el Co líquido en la cámara de presión y las moléculas de Co gaseosas que se evaporan rápidamente alcanza un equilibrio dinámico. A medida que la temperatura aumenta gradualmente, la evaporación del Co líquido se acelera y la densidad disminuye en consecuencia. Cuando la temperatura crítica del Co se alcanza a 31,1°C, la densidad de las fases gaseosa y líquida es la misma, y la diferencia entre las dos fases desaparece por completo, es decir, se alcanza el equilibrio de fases y la tensión superficial es cero. en este momento. Mantenga la temperatura ligeramente por encima de la temperatura crítica y descargue lentamente el gas Co. Cuando se agote el gas Co, la muestra estará seca. Saque la muestra seca y rocíela con una capa de aleación de carbono mediante pulverización al vacío, o colóquela en una máquina de revestimiento iónico para recubrirla con platino y oro para aumentar la conductividad de la muestra, mejorar el contraste y mejorar la estabilidad de la muestra. muestra. Luego se puede realizar una microscopía electrónica de barrido.
El microscopio electrónico de barrido tiene muchas ventajas como alta resolución, gran profundidad de campo, amplio campo de visión, visualización de estructura tridimensional, fácil observación y preparación sencilla de muestras. Se utiliza cada vez más en biología y. Medicina para observación y estudio de la morfología y estructura tridimensional interna de especímenes biológicos. El poder de resolución del microscopio electrónico de barrido ha alcanzado el nivel 70 y se puede observar directamente la estructura molecular del ácido desoxirribonucleico (ADN).