La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que se utiliza para amplificar fragmentos de ADN específicos. Puede considerarse como un tipo especial de replicación del ADN in vitro. La ADN polimerasa I se descubrió por primera vez en 1955, y el Dr. H. Klenow descubrió el fragmento Klenow de E. coli, más valioso y práctico desde el punto de vista experimental, a principios de la década de 1970. Sin embargo, dado que esta enzima no es resistente a altas temperaturas y puede desnaturalizarse a altas temperaturas, no es adecuada para reacciones en cadena de la polimerasa de desnaturalización a altas temperaturas. La enzima utilizada actualmente (Taq polimerasa para abreviar) se aisló de Thermus thermophilus en aguas termales en 1976. Es una enzima ideal debido a su resistencia a altas temperaturas, pero se utilizó ampliamente después de la década de 1980. El concepto prototipo original de PCR era una replicación de reparación genética similar, propuesta por el Dr. Kjell Kleppe en 1971. Publicó el primer experimento de replicación de genes simple y corto (análogo a los dos primeros ciclos de PCR). La PCR desarrollada hoy fue desarrollada por el Dr. Cary B. Mullis en 1983. En aquel entonces, el Dr. Mullis trabajaba para una empresa de PE, por lo que la empresa de PE tenía una posición especial en el campo de la PCR. El Dr. Mullis publicó el primer artículo relacionado en 1985 con Zhai Si y otros. Desde entonces, la aplicación de la PCR ha avanzado a pasos agigantados, y se puede decir que la calidad de los artículos relacionados no tiene comparación con muchos otros métodos de investigación. Posteriormente, la tecnología de PCR se utilizó ampliamente en la investigación biológica y en aplicaciones clínicas, convirtiéndose en la tecnología más importante en la investigación de biología molecular. Mullis también ganó el Premio Nobel de Química en 1993.
2 Principio de la PCR
El principio básico de la tecnología de la PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la diana. secuencia. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-recocido-extensión:
(1) Desnaturalización del ADN molde: después de calentar el ADN molde a aproximadamente 93 °C durante un cierto período de tiempo, la doble cadena ADN o PCR del ADN molde El ADN bicatenario formado por amplificación se disocia para combinarse con el cebador y prepararse para la siguiente ronda de reacción;
(2) Recocido (renaturalización) del ADN molde y el cebador : El ADN molde se calienta y se desnaturaliza. Después de ser monocatenario, la temperatura se reduce a aproximadamente 55 °C y el cebador se empareja con la secuencia complementaria del molde de ADN monocatenario;
③Extensión del cebador : El conjugado plantilla-cebador de ADN está recubierto de dNTP bajo la acción de la ADN polimerasa Taq. Como materia prima para la reacción, la secuencia objetivo es la plantilla. Según los principios de emparejamiento de bases complementarias y replicación semiconservadora, se forma una nueva semi. -Se puede sintetizar una cadena de replicación conservadora complementaria a la cadena de ADN plantilla. Repitiendo los tres procesos de desnaturalización-hibridación-extensión, se puede obtener más esta nueva cadena que puede servir como plantilla para el siguiente ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar un ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar un millón de veces en 2 a 3 horas.
3 Sistema de reacción de PCR y condiciones de reacción
3.1 Sistema de reacción de PCR estándar
10×tampón de amplificación 10μl
Cuatro tipos de mezcla de 200μl de dNTP.
Primer 10 ~ 100 μl
ADN plantilla 0,1 ~ 2 μ g
ADN polimerasa Taq 2,5 μl
Mg2 1,5 mmol/L
Añadir el doble o el triple de 100 μ l de agua destilada
3.2 Cinco elementos de la reacción de PCR
Hay cinco sustancias principales implicadas en la reacción de PCR, a saber, los cebadores ( Los cebadores de PCR son fragmentos de ADN y los cebadores para la replicación del ADN intracelular son cadenas de ARN), enzimas, dNTP, plantillas y tampones (requiere Mg2). [[Pasos de la PCR]
El proceso de PCR estándar se divide en tres pasos:
1. Desnaturalización del ADN (90 ℃ -96 ℃): bajo la acción del calor, el doble Plantilla de ADN hebrado Los enlaces de hidrógeno se rompen, formando ADN monocatenario.
2. Recocido (25 ℃ -65 ℃): la temperatura del sistema disminuye y los cebadores se combinan con la plantilla de ADN para formar dobles hebras parciales.
3. Extensión (70℃-75℃): Bajo la acción de la enzima Taq (alrededor de 72℃, la mejor actividad), utilizando dNTP como materia prima, extienda desde el extremo 5' del cebador hasta el extremo 3', sintetiza una cadena de ADN complementaria al molde.
Después de cada ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión, el contenido de ADN se duplica. En la actualidad, algunas PCR se pueden replicar en poco tiempo porque la región de amplificación es muy corta, incluso si la actividad de la enzima Taq no es óptima. Por lo tanto, se puede cambiar a un método de dos pasos, es decir, el hibridación y la extensión. Realizado simultáneamente a 60 °C-65 °C para reducir un paso. Los procesos de calentamiento y enfriamiento aumentan la velocidad de reacción.
4 Características de la reacción de PCR
4.1 tiene una fuerte especificidad.
Los determinantes específicos de la reacción de PCR son:
①La combinación específica y correcta de cebadores y ADN molde;
②El principio de emparejamiento de bases;
③La autenticidad de la reacción de síntesis de la ADN polimerasa Taq;
④La especificidad y conservación del gen objetivo.
La combinación correcta de primers y plantillas es clave. La unión del cebador al molde y la extensión de la cadena del cebador siguen el principio de apareamiento de bases. Debido a la fidelidad de la reacción de síntesis de la polimerasa y la resistencia a altas temperaturas de la ADN polimerasa Taq, la combinación (renaturalización) de la plantilla y el cebador en la reacción se puede realizar a una temperatura más alta, la especificidad de la combinación aumenta considerablemente y El gen objetivo amplificado es Los fragmentos pueden mantener una alta precisión. Al seleccionar regiones genéticas objetivo con alta especificidad y conservación, la especificidad será mayor.
4.2 Alta sensibilidad
La cantidad de producto de PCR aumenta exponencialmente y la plantilla inicial a probar se puede amplificar a μg=-6 en el picogramo (pg=10-12) nivel. Se puede detectar una célula diana entre 6,5438 millones de células; en la detección de virus, la sensibilidad de la PCR puede alcanzar 3 RFU (unidades formadoras de placa), la tasa de detección más baja es de 3 bacterias;
4.3 Sencillo y rápido
En reacciones de PCR se utiliza la ADN polimerasa Taq resistente a altas temperaturas. Después de agregar la solución de reacción de una vez, la reacción de desnaturalización-hibridación-extensión se realiza en la solución de amplificación de ADN y en el baño de agua. La reacción de amplificación generalmente se completa en 2 a 4 horas. Los productos de amplificación generalmente se analizan mediante electroforesis, que no requiere isótopos, por lo que no hay contaminación radiactiva y es fácil de promover.
4.4 La pureza de la muestra es baja.
No es necesario aislar virus o bacterias ni cultivar células, y se pueden utilizar ADN y ARN crudos como plantillas de amplificación. Puede usarse directamente para la amplificación de ADN y la detección de muestras clínicas como sangre, líquido de cavidades corporales, enjuague bucal, cabello, células y tejidos vivos.
5 Preguntas Frecuentes sobre PCR
5.1 Falso negativo, sin banda de amplificación.
Los aspectos clave de la reacción de PCR son ① la preparación del ácido nucleico molde, ② la calidad y especificidad del cebador, ③ la calidad de la enzima y ④ las condiciones del ciclo de PCR. Para encontrar las razones, también debemos analizar y estudiar los enlaces anteriores.
Plantilla: ① La plantilla contiene proteínas, ② La plantilla contiene inhibidores de la enzima Taq, ③ Las proteínas de la plantilla no se eliminan, especialmente las histonas en los cromosomas, ④ Se pierde durante la extracción y preparación de la plantilla. Demasiado o inhalación de fenol. ⑤El ácido nucleico plantilla no está completamente desnaturalizado. Cuando la calidad de la enzima y los cebadores es buena, no hay banda de amplificación, lo que probablemente se debe a un fallo en la digestión de la muestra y en el proceso de extracción del ácido nucleico molde. Por lo tanto, para preparar un jugo digestivo eficaz y estable, el procedimiento debe ser fijo y no puede modificarse a voluntad.
Inactivación enzimática: Es necesario sustituir la nueva enzima o utilizar la antigua y la nueva al mismo tiempo, y analizar si el falso negativo se debe a la pérdida o deficiencia de la actividad enzimática. Tenga en cuenta que a veces se olvida la enzima Taq o el bromuro de etidio.
Cebadores: La calidad del cebador, la concentración del cebador y si la concentración de los dos cebadores es simétrica son razones comunes para el fallo de la PCR o bandas de amplificación insatisfactorias, que son fáciles de dispersar. Existen problemas con la calidad de la síntesis de cebadores en algunos lotes. Uno de los dos cebadores tiene una concentración alta y el otro tiene una concentración baja, lo que da como resultado una eficiencia de amplificación asimétrica baja. Las contramedidas son las siguientes: ① Seleccionar buenos cebadores para sintetizar una sola posición. ②La concentración de los cebadores depende no solo del valor de DO, sino también de la electroforesis en gel de agarosa de la solución madre del cebador. Debe haber una banda de cebador y el brillo de las dos bandas de cebador debe ser aproximadamente el mismo.
Por ejemplo, si un cebador tiene una banda y el otro no, la PCR puede fallar. Deberá negociar con la unidad de síntesis de cebadores para resolver el problema. Si una imprimación tiene un brillo alto y otra tiene un brillo bajo, equilibre las concentraciones al diluir la imprimación. (3) Los imprimadores deben almacenarse en paquetes pequeños de alta concentración para evitar que se deterioren debido a la congelación y descongelación repetidas o al almacenamiento prolongado en el refrigerador. ④El diseño del cebador no es razonable. Si la longitud del cebador no es suficiente, se formarán dímeros entre los cebadores.
Concentración de Mg2: La concentración de iones Mg2 tiene un gran impacto en la eficiencia de la amplificación por PCR. Una concentración demasiado alta reducirá la especificidad de la amplificación por PCR, y una concentración demasiado baja afectará el rendimiento de la amplificación por PCR o incluso hará que la amplificación por PCR falle sin producir una banda de amplificación.
Cambios en el volumen de reacción: Habitualmente, los volúmenes utilizados para la amplificación por PCR son 20ul, 30ul y 50ul. O 100ul. El volumen que se utilizará para la amplificación por PCR se establece en función de los diferentes propósitos de la investigación científica y las pruebas clínicas. Al fabricar volúmenes pequeños, como 20 ul, asegúrese de configurar las condiciones del modo; de lo contrario, fallará fácilmente.
Razones físicas: la desnaturalización es muy importante para la amplificación por PCR. Si la temperatura de desnaturalización es baja y el tiempo de desnaturalización es corto, es fácil producir falsos negativos. amplificación y reducir la eficiencia de amplificación específica. Una temperatura de hibridación excesivamente alta afectará la unión de cebadores y plantillas y reducirá la eficiencia de la amplificación por PCR. A veces es necesario utilizar un termómetro estándar para detectar las temperaturas de desnaturalización, recocido y extensión en el amplificador o en el recipiente soluble en agua, lo que también es una de las razones del fallo de la PCR.
Variación de la secuencia diana: Si la secuencia diana está mutada o eliminada, lo que afecta la unión específica del cebador y el molde, o el cebador y el molde pierden la secuencia complementaria debido a la eliminación de un cierto segmento de la secuencia objetivo, la amplificación por PCR fallará.
5.2 Falso Positivo
La banda de amplificación por PCR es consistente con la banda de la secuencia objetivo y, a veces, la banda es más clara y brillante.
Diseño de cebador inadecuado: La secuencia de amplificación seleccionada tiene homología con la secuencia de amplificación no objetivo, por lo que al realizar la amplificación por PCR, el producto de PCR amplificado es una secuencia no objetivo. Si la secuencia objetivo es demasiado corta o el cebador es demasiado corto, pueden producirse falsos positivos. Es necesario rediseñar los cebadores.
Contaminación cruzada de secuencias objetivo o productos de amplificación: Hay dos razones para esta contaminación: en primer lugar, la contaminación cruzada de todo el genoma o de fragmentos grandes conduce a falsos positivos. Este falso positivo se puede resolver manejándolo con cuidado y suavidad para evitar que la secuencia objetivo sea succionada por la pistola de carga o salpicada del tubo de centrífuga. Todos los reactivos o equipos, excepto las enzimas y sustancias que no pueden soportar altas temperaturas, deben esterilizarse en autoclave. Los tubos de centrífuga y las puntas de pipeta de inyección utilizados deben utilizarse una vez. Si es necesario, los tubos de reacción y los reactivos se irradian con luz ultravioleta antes de añadir la muestra para destruir los ácidos nucleicos presentes. El segundo es la contaminación de pequeños fragmentos de ácidos nucleicos en el aire. Estos pequeños fragmentos son más cortos que la secuencia objetivo, pero tienen cierta homología. Se pueden empalmar entre sí y, después de ser complementarios de los cebadores, los productos de la PCR se pueden amplificar, lo que da como resultado falsos positivos, que pueden reducirse o eliminarse mediante PCR anidada.
5.3 Aparecen bandas de amplificación no específicas
Las bandas después de la amplificación por PCR no coinciden con el tamaño esperado, ya sean grandes o pequeñas, o bandas de amplificación específicas y bandas de amplificación no específicas Las bandas aparecen simultáneamente. Hay dos razones para la aparición de bandas no específicas: primero, el cebador no es completamente complementario a la secuencia objetivo, o el cebador se agrega para formar un dímero. En segundo lugar, una concentración demasiado alta de iones Mg2 y una temperatura de recocido demasiado baja están relacionadas con demasiados ciclos de PCR. El segundo es la calidad y cantidad de la enzima. A menudo, algunas enzimas de determinadas fuentes son propensas a formar bandas no específicas pero otras no. A veces, si la cantidad de enzima es demasiado alta, se producirá una amplificación no específica. Esto es lo que debe hacer: Rediseñe la guía si es necesario. Reduzca la cantidad de enzima utilizada o reemplace la enzima de otra fuente. Reduzca la cantidad de cebadores, aumente la cantidad de plantilla de manera adecuada y reduzca el número de ciclos. Aumente la temperatura de recocido adecuadamente o utilice el método de punto de temperatura dual (desnaturalización a 93 °C, extensión del recocido a aproximadamente 65 °C).
5.4 Aparecen bandas manchadas o manchadas
A veces aparecen bandas manchadas, escamosas o con forma de alfombra durante la amplificación por PCR. Las razones suelen ser demasiada enzima o mala calidad de la enzima, una concentración demasiado alta de dNTP, una concentración demasiado alta de Mg2, una temperatura de recocido demasiado baja y demasiados ciclos. Las contramedidas incluyen: ① Reducir la dosis de enzima o reemplazar enzimas de otras fuentes. ②Reducir la concentración de dNTP. ③Reduzca adecuadamente la concentración de Mg2.
(4) Aumente la cantidad de plantillas y reduzca el número de ciclos.