El 8 de septiembre de 1895, Roentgen estaba realizando experimentos con rayos catódicos. Los rayos catódicos están formados por haces de electrones. Cuando se aplica un alto voltaje entre los electrodos en los extremos de un tubo de vidrio cerrado que está casi completamente vacío, se produce un flujo de electrones. Los rayos catódicos no tienen un poder de penetración especialmente fuerte y tienen dificultades para penetrar incluso unos pocos centímetros de aire. Esta vez, Roentgen cubrió completamente los rayos catódicos con un grueso papel negro para que, incluso si la corriente pasara a través de ellos, la luz emitida por el tubo de vidrio no fuera visible. Sin embargo, cuando Roentgen encendió el circuito del tubo de rayos catódicos, se sorprendió al descubrir que una pantalla fluorescente en un banco de trabajo cercano (recubierta con la sustancia fluorescente cianuro de bario platino) comenzó a brillar, como si fuera estimulada por la lámpara. Cortó la corriente al tubo de rayos catódicos y la pantalla dejó de brillar. Debido a que el tubo de rayos catódicos estaba completamente cubierto, Roentgen pronto se dio cuenta de que debía emitirse alguna radiación invisible desde el cátodo cuando se activaba la corriente. Debido a las misteriosas propiedades de esta radiación, la llamó "rayos X": X se utiliza a menudo para representar una cantidad desconocida en matemáticas.
Este descubrimiento inesperado entusiasmó a Roentgen. Dejó de lado otros trabajos de investigación y se concentró en estudiar las propiedades de los rayos X. Después de semanas de intenso trabajo, descubrió los siguientes hechos. (1) Los rayos X no sólo pueden hacer que el cianuro de bario y el platino sean fluorescentes, sino que también pueden hacer que muchas otras sustancias químicas sean fluorescentes. (2) Los rayos X pueden penetrar muchas sustancias que la luz ordinaria no puede penetrar, en particular, pueden pasar directamente a través de los músculos pero no a través de los huesos; Röntgen colocó su mano entre el tubo de rayos catódicos y la pantalla, y los huesos de su mano fueron visibles en la pantalla. (3) Los rayos X viajan en línea recta. A diferencia de las partículas cargadas, los campos magnéticos no anulan los rayos X.
En febrero de 1995, Röntgen escribió su primer artículo sobre rayos X, que inmediatamente despertó gran interés y entusiasmo. En tan solo unos meses, cientos de científicos estaban estudiando los rayos X, ¡y se publicaron alrededor de 1.000 artículos relacionados al año! Anthony Henry Baker Lehr fue uno de los científicos que se inspiró directamente en el invento de Roentgen. Aunque Becquerel estaba estudiando deliberadamente los rayos X, descubrió accidentalmente un fenómeno de radiación más importante.
En general, siempre que un objeto es bombardeado por electrones de alta energía, se producen rayos X. Los rayos X en sí no están hechos de electrones, sino de ondas electromagnéticas. Entonces, este tipo de radiación es básicamente similar a la radiación de luz visible (es decir, ondas de luz), excepto que la longitud de onda es mucho más corta.