1. Propósito: Establecer procedimientos operativos estándar para la inspección de esterilidad para garantizar la precisión de los resultados de la inspección. 2. Alcance: Aplicable a la inspección de esterilidad de las inyecciones producidas por el laboratorio del Departamento de Supervisión de Calidad de la fábrica. 3. Responsabilidad: Los técnicos de laboratorio son responsables de operar de acuerdo con estos procedimientos operativos y son responsables de los resultados de la inspección. 4. Definición: El método de prueba de esterilidad se refiere a un método para verificar si los medicamentos son estériles. 5. Contenido: 5.1 Equipo operativo esterilizado: quirófano esterilizado o mesa de trabajo ultralimpia, ropa esterilizada, mascarillas, gorros, zapatos esterilizados, lámpara de alcohol, etc. 5.1.1 La sala estéril se divide en un quirófano estéril y una sala intermedia. En la sala intermedia debe haber lavabos, secadores de manos, percheros y ganchos para ropa esterilizada, zapatillas, etc. El quirófano estéril debe tener un dispositivo de flujo laminar para la esterilización y filtración del aire y una mesa de trabajo ultralimpia con nivel de limpieza local 100. Tanto la sala de amortiguación como el quirófano están equipados con luces ultravioleta y lámparas de iluminación que pueden lograr la desinfección del aire. El quirófano o la mesa de trabajo deben mantener una presión de aire positiva. 5.1.2 La sala estéril debe limpiarse con una solución de clormetionina al 0,1% o cresol al 2% cada semana y antes de cada operación, y se deben limpiar la mesa de operaciones y las esquinas potencialmente contaminadas, y se deben encender el filtro de aire estéril y la luz ultravioleta durante esterilización durante 1 hora. Después de cada operación, limpie la superficie de trabajo con una solución de cresol al 2% o de cloruro de benzalconio al 0,1% y esterilícela con luz ultravioleta durante media hora. 5.1.3 Inspección del grado de esterilidad de la sala estéril: Después de la desinfección, es necesario verificar la cantidad de colonias bacterianas en el aire antes de la prueba de esterilidad y durante el funcionamiento de la sala estéril. Tome un plato doble con un diámetro de 90 mm, encienda la lámpara de alcohol en la sala de inoculación, al lado de la lámpara de alcohol, use una operación aséptica, abra hasta la mitad el plato doble e inyecte aproximadamente 20 ml de medio de agar nutritivo disuelto para hacer un plato: pre -incubar a 35-37°C durante 48 horas, después de comprobar la esterilidad, llevar las 3 placas al área limpia del quirófano estéril de manera estéril y colocar una a la izquierda, al medio y a la derecha respectivamente; cúbralo y abróchelo, y cubra la placa después de exponerla al aire durante 30 minutos. Bien, incube a 35-37 ° C durante 48 horas, sáquela y verifique que el número total de colonias que crecen en las tres placas no debe. exceder de 10. Los departamentos pertinentes deben comprobar periódicamente la limpieza de la mesa de operaciones estéril o del banco de trabajo ultralimpio, que debe alcanzar el nivel 100 (normalmente se utiliza un contador de partículas de polvo, el número de partículas con un diámetro de ≤5 μm no debe exceder). 3,5 partículas/litro; caudal de aire. Debe controlarse a 0,75-1,0 m3/s; el número promedio de colonias bacterianas es 1. El filtro se puede reemplazar periódicamente según el estado de esterilidad. 5.1.4 En la sala esterilizada se debe preparar un frasco de vidrio que contenga cresol al 5% para desinfección, una lámpara de alcohol, fósforos, pinzas, algodón con alcohol al 75% y pantuflas. 5.2 Instrumentos y utensilios: 5.2.1 Bomba de vacío, incubadora de temperatura constante, microscopio biológico, balanza de bandeja (precisión 0,1 g), botella con filtro de succión (500 ml), matraz Erlenmeyer (100, 500 ml), pipeta (1, 10 ml), jeringa ( especificaciones requeridas), tubo de ensayo, plato doble (9 cm), aguja de inyección, pinzas, tijeras, orejas de platino, tubo de goma, gasa, algodón (algodón crudo), tubo de paja de acero inoxidable, asa de inoculación, membrana de filtro microporosa (aproximadamente 5 cm de diámetro). ), la apertura debe ser de 0,45 ± 0,02 μm) diapositiva, lámpara rociadora, cuchara de muestreo, bola de succión para la oreja, botella rociadora. 5.2.2 Envoltura del equipo: 5.2.2.1 Coloque la pipeta en el extremo superior de la pipeta, rellénela sin apretar con un poco de algodón crudo y luego colóquela en un cilindro de esterilización de acero inoxidable. 5.2.2.2 Tapar la boca del tubo de ensayo con una gasa y un tapón de algodón. 5.2.2.3 Ropa, pantalones, gorros y mascarillas esterilizados Coloque la ropa, pantalones, gorros y mascarillas lavadas en una bolsa de tela, ate bien la boca de la bolsa y envuélvala en papel kraft. 5.2.2.4 Una vez ensamblada la jeringa, la jeringa lavada y la aguja de inyección se colocan en un recipiente tapado (caja de arroz) forrado con gasa, capa por capa, cubierto con gasa, y luego se tapa el recipiente y se envuelve en marrón. papel. 5.2.2.5 Filtro: Después de pasar la inspección, sumerja la membrana del filtro microporoso en agua para humedecerla, sáquela y fíjela en la placa del filtro bacteriano. Utilice juntas resistentes a altas temperaturas para rellenar la placa del filtro y el filtro. membrana y luego instale el filtro.
Antes de esterilizar, no apriete demasiado el tornillo del filtro. Envuelva la parte superior del filtro con 8 capas de gasa y papel kraft. Después de instalarlo, colóquelo en el recipiente. Luego cubra el recipiente que contiene el filtro y envuélvalo. con papel kraft. 5.2.3 Esterilización de utensilios: Esterilice los utensilios envueltos en un gabinete de esterilización por vapor a 121 ± 0,5 ℃ durante 30 minutos. Al sacar los artículos, no los coloque en un lugar frío inmediatamente para evitar un rápido enfriamiento y esterilización de los artículos. provocar la condensación de vapor y provocar una carga puede provocar fácilmente una contaminación bacteriana, por lo que debe colocarse en una incubadora o calentarse y secarse. 5.3 Medio y reactivos: 5.3.1 Generalmente se utiliza medio de cultivo seco comercial y se prepara de acuerdo con las instrucciones de uso antes de su uso. Cabe señalar que el valor de pH del medio de cultivo debe cumplir con las regulaciones, de lo contrario debe cumplirse. calibrado y esterilizado antes de su uso. Antes de su uso, el medio de cultivo bacteriano que ha sido empaquetado y esterilizado según sea necesario debe cultivarse a 30-35 °C durante 48 horas, y el medio de cultivo de hongos debe cultivarse a 20-25 °C durante 72 horas para demostrar un crecimiento estéril antes. usar. El medio de cultivo preparado para bacterias aeróbicas y anaeróbicas debe consumirse dentro de medio mes antes de la inoculación de la muestra de prueba, el color de la capa de oxidación del indicador del medio de cultivo no debe exceder aproximadamente 1/5 de la profundidad del cultivo. medio, de lo contrario se debe calentar hirviendo al baño maría, solo se puede calentar una vez. 5.3.2 Solución de yodo de Gram: Primero disuelva 2,0 g de yoduro de potasio en 3-5 ml de agua destilada, luego agregue 1,0 g de tabletas de yodo, revuelva y disuelva, agregue agua destilada para diluir a 300 ml y agite bien. Guárdelo en una botella marrón sellada para su uso posterior. 5.3.3 Solución de tinte violeta cristal: Disolver 1,0 g de violeta cristal en 20 ml de etanol 95, mezclar con 80 ml de solución de oxalato de amonio y dejar reposar durante 48 horas antes de su uso. Esta solución es estable y se puede almacenar en una botella marrón sellada durante varios meses. 5.3.4 Solución de teñido de Sahuang: Disuelva 0,2 g de Sahuang en 10 ml de etanol 95. Después de la disolución completa, agregue agua destilada a 100 ml. 5.3.5 Solución salina fisiológica: Pesar 9 g de cloruro de sodio, agregar 1000 ml de agua para disolver, dividir en alícuotas y esterilizar con calor húmedo a 121 ± 0,5 ℃ durante 30 minutos. Para uso como diluyente. Página 4/***7 5.3.6 Etanol 75 Mida 75 ml de etanol absoluto, agregue agua para diluir hasta 100 ml, agite bien y estará listo. 5.3.7 0.1 sulfametoxazol: medir 20ml de 5 sulfametoxazol, agregar agua para diluir hasta unos 1000ml, agitar bien y listo. 5.4 Inspección de sensibilidad del medio de cultivo: 5.4.1 La calidad de los medios de cultivo secos recién comprados o de los medios de cultivo frescos que utilizan diferentes marcas de materias primas debe cumplir con los requisitos de inspección de sensibilidad. (1) Tome cultivos frescos de agar inclinado nutritivo de Micrococcus luteus CMCC (B) 28001] y agar inclinado de cultivo de hongos de Candida albicans CMCC (F) 98001, y use una solución estéril al 0,9 respectivamente. Use una solución de cloruro de sodio para obtener una mezcla uniforme. suspensión bacteriana; tomar un cultivo fresco de Clostridium sporogenes [CMCC (B) 64941] sin agar en un medio aeróbico y anaeróbico, y utilizar un capilar esterilizado para aspirarlo hasta la esterilización de las bacterias en un tubo de centrífuga, centrifugar, desechar el sobrenadante, precipitar. las bacterias y utilice una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9 para preparar una suspensión bacteriana uniforme. Luego, después de una dilución en serie de 10 veces, se preparó y contó 1 ml que contenía entre 10 y 100 bacterias. (2) Tomar cultivos frescos de Micrococcus luteus y Clostridium sporogenes de medios aeróbicos y anaeróbicos, y cultivos frescos de Candida albicans del agar inclinado del medio de cultivo de hongos e inocularlos en el medio de cultivo de moho, 20-25 ℃, diluir 10 veces con una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9 para obtener 1 ml que contenga de 10 a 100 bacterias y contarlas. Inocular 1 ml de cada una de las diluciones de los anteriores (1) o (2) de Micrococcus luteus en 3 tubos de medio de cultivo de bacterias aeróbicas y anaeróbicas que contengan cada uno 9 ml, y el anterior (1) de Clostridium sporogenes o 1 ml del diluyente. de (2), inocular en 3 tubos de medio de cultivo de bacterias aeróbicas y anaeróbicas, cada uno de los cuales contiene 12 ml, e inocular 1 ml del diluyente de (1) o (2) anterior para Candida albicans. Llene 3 tubos con 9 ml de cultivo de hongos. medio en cada tubo. Utilice el medio de cultivo no inoculado como control. Cultive a la temperatura especificada durante 5 días y registre los resultados diariamente.
Juicio de resultado: El medio de cultivo después de la inoculación de cada cepa de bacteria no debe tener menos de 2 tubos que muestren crecimiento, es decir, la prueba de sensibilidad del medio de cultivo cumple con los requisitos. 5.4.2 El medio de cultivo preparado debe almacenarse en un lugar fresco y oscuro, generalmente no más de 2 semanas. Antes de su uso, los medios de cultivo de bacterias y moho deben cultivarse a 30-35 ℃ y 20-25 ℃ durante no menos de. 48 horas y 72 horas respectivamente para demostrar que se puede utilizar después de un crecimiento estéril. 5.4.3 La altura del medio de cultivo para bacterias aeróbicas y bacterias anaeróbicas en el tubo de ensayo no deberá ser inferior a 7 cm, y la capa de óxido indicador no deberá exceder 1/5 de la profundidad del medio de cultivo. Hervir al baño maría durante 10 minutos, pero sólo calentando una vez. Página 5/***7 Al final del tiempo de incubación de la prueba de esterilidad, la capa de oxidación del indicador no debe exceder la mitad de la profundidad del medio de cultivo. 5.5 Preparación de la solución bacteriana de control: 5.5.1 Cepas bacterianas de prueba, cepas. La recuperación, inoculación y conservación de cepas bacterianas debe realizarse de acuerdo con los procedimientos operativos estándar del "Método de ensayo microbiológico de antibióticos". 5.5.2 Utilice un asa de inoculación para tomar un poco de cultivo fresco de Staphylococcus aureus [Staphy-lococcus aureus CMCC (B) 26003] del agar nutritivo inclinado e inocularlo en el medio de cultivo del caldo nutritivo después de cultivar durante 16 a 18 horas a. ℃, diluya la solución bacteriana de Clostridium sporogenes con solución salina fisiológica estéril a 1:1065.5.3. Utilice un asa de inoculación para recolectar las bacterias aeróbicas y anaeróbicas de Clostridium sporogenes [CMCC (B) 64941] para cultivo. en el mismo medio de cultivo, incubar a 30-35°C durante 18-24 horas y luego diluirlo a 1:106 con solución salina estéril. 5.5.4 Tomar el líquido de Candida albicans con un asa de inoculación. Un cultivo fresco de Candida albicans [. CMCC (F) 98001] en un medio de agar fúngico inclinado 1 Hongo de platino, inoculado en el medio fúngico, cultivado a 20-25°C durante 24 horas, diluido a 1:105 con solución salina fisiológica estéril 5.5.5 La solución bacteriana preparada. Lo anterior generalmente se usa el mismo día. 5.6 Puntos clave para ingresar a la sala estéril: 5.6.1 De acuerdo con el procedimiento de prueba, mueva los utensilios y artículos a la sala de amortiguación, encienda la luz ultravioleta y el dispositivo de filtro de aire y déjelos funcionar durante más de 1 hora. 5.6.2 El operador se lava las manos con agua y jabón, apaga la luz ultravioleta en la sala de amortiguamiento, ingresa a la sala de amortiguamiento, cierra la primera puerta, se lava las manos con una solución de 2 Lysol o clorfeniramina 0,1 y las seca con una toalla esterilizada. , y se pone ropa no tóxica, gorras, mascarillas y calzado esterilizado. 5.6.3 Apague la luz ultravioleta en la habitación esterilizada, entre por la segunda puerta, mueva los utensilios a la habitación esterilizada y cierre la puerta de la habitación esterilizada. 5.6.4 Después de ingresar a la sala estéril, no se debe salir a recoger artículos, por lo que se deben planificar los artículos utilizados en cada prueba y preparar artículos de repuesto. Desde que ingresa por la primera puerta a la sala estéril, se debe rociar 2 Lysol o una solución de sulfato 0,1 cuando el operador ingresa. 5.7 Métodos de inspección: 5.7.1 Los métodos de inspección de esterilidad incluyen: método de inoculación directa y método de filtración por membrana. El primero es adecuado para artículos de prueba con efecto no antibacteriano; el segundo es adecuado para artículos de prueba con efecto antibacteriano o de gran capacidad. 5.7.2 Durante el funcionamiento, la superficie del recipiente debe empaparse o limpiarse con cloruro 0,1 y luego retirarse el contenido de forma estéril. 5.7.3 En todas las pruebas de esterilidad, los solventes y diluyentes correspondientes deben usarse de la misma manera que los controles negativos. 5.7.4 Preparación de la muestra de prueba: Use fórceps esterilizados para sacar la jeringa, inserte el núcleo de la aguja en la jeringa al lado de la llama e instale la aguja. Cuando la cubierta sea un tapón de goma, use la jeringa para insertar la jeringa en el. centro del tapón de goma esterilizado para absorber el líquido. Para las muestras de prueba que deben diluirse o inactivarse de acuerdo con las regulaciones, la solución de prueba en la botella se puede extraer directamente o extraerse en un recipiente de vidrio esterilizado para el tratamiento de inactivación y diluirse al volumen y concentración especificados al extraer el líquido en la botella; debe ser El artículo de prueba se voltea con la aguja debajo de la superficie del líquido. 5.7.5 Método de inoculación directa: medir la muestra de prueba de acuerdo con las regulaciones, inocular la muestra de prueba en 6 tubos de medio de cultivo de bacterias aeróbicas y bacterias anaeróbicas mediante operación aséptica e inocular 1 ml de líquido de Staphylococcus aureus en un tubo como positivo. control, inocular otros 5 tubos de medio de cultivo de hongos. Agite suavemente para mezclar la muestra de prueba con el medio de cultivo.
Los tubos de medio de cultivo para bacterias aeróbicas y bacterias anaeróbicas deben colocarse a 30-35°C, y los tubos de medio de cultivo para hongos deben colocarse a 20-25°C durante 7 días. Durante el período de cultivo, se debe observar y registrar diariamente el crecimiento bacteriano. El tubo de control positivo debe tener crecimiento bacteriano dentro de las 24 horas. Si el medio de cultivo se vuelve turbio después de agregar el producto de prueba y después de 7 días de cultivo, no se puede juzgar por la apariencia si hay crecimiento de microorganismos en una cantidad adecuada. El medio de cultivo se puede transferir a un cultivo fresco de la misma especie. Continúe cultivando en la base o en el medio de cultivo inclinado. Cultive las bacterias durante 2 días y los hongos durante 3 días. Observe si vuelve a aparecer turbidez o hay crecimiento estéril en el. Incline o use un asa de inoculación para tomar una muestra del líquido de cultivo, teñirlo y usar un microscopio para observar si hay bacterias. 5.7.6 Método de filtración por membrana: conecte el dispositivo de filtración por membrana microporosa, la botella de filtro de succión, el tubo de escape y la bomba de vacío. La bomba de vacío se puede colocar fuera de la sala estéril. Tome la cantidad prescrita de muestra de prueba, procese según el método prescrito, agréguela a 100 ml de solución estéril de cloruro de sodio 0,9, mézclela, pásela a través de un filtro de membrana equipado con un tamaño de poro no superior a 0,45 μm, escúrrala bajo presión reducida y filtrar con solución estéril de cloruro de sodio 0,9. Enjuagar la membrana del filtro 3 veces con solución bacteriana de cloruro de sodio, al menos 100 ml cada vez, sacar la membrana del filtro y dividirla en 3 partes iguales, agregarlas a las dos anteriores. medios de cultivo respectivamente, y cultivo según la temperatura y el tiempo especificados. Al tubo de control positivo se le debe agregar 1 ml de la solución de bacterias de control correspondiente de acuerdo con las características del producto de prueba (fármacos antibacterianos, Staphylococcus aureus se usa como bacteria de control; medicamentos antianaeróbicos, Clostridium sporogenes se usa como bacteria de control; medicamentos antimicóticos, Candida albicans se utiliza como bacteria de control) bacterias de control). Las bacterias en el tubo de control positivo se deben cultivar durante 24 a 48 horas y los hongos se deben cultivar durante 24 a 72 horas para el crecimiento bacteriano. 5.8 Juicio de resultados: Página 7/***7 Cuando el tubo de control positivo está turbio y las bacterias crecen, y el tubo de control negativo es negativo, se puede juzgar en función de los resultados observados: si se necesitan aerobacterias, bacterias anaeróbicas y hongos. Si todos los tubos del medio de cultivo son transparentes o turbios pero se demuestra que no tienen crecimiento bacteriano, el producto de prueba se considerará calificado si alguno de los tubos de cultivo de aerobacterias, bacterias anaeróbicas y hongos está turbio y se confirma que tiene crecimiento bacteriano, 2 veces; la cantidad de la muestra de prueba debe tomarse nuevamente y volverse a analizar de acuerdo con la ley. Excepto en el tubo de control positivo, ninguna bacteria debe crecer en ningún otro tubo; de lo contrario, la muestra de prueba debe considerarse no calificada. 6 Formación 6.1 Objetos de formación: técnicos de laboratorio. 6.2 Tiempo de formación: dos horas. 7 Registro Nombre del registro Departamento de almacenamiento Tiempo de almacenamiento Registro de inspección de esterilidad Departamento de supervisión de calidad Un año después de la fecha de vencimiento del medicamento QF-01-007-00 Registro de inspección de esterilidad Nombre del producto: Número de lote: Especificación: Fecha de inspección: Año Mes Día Nombre del medio de cultivo Necesidades Gas, anafilaxia Medio de aerobacterias Medio de cultivo de hongos Temperatura de cultivo 30-35 ℃ 20-25 ℃ Tiempo de cultivo Número de tubo 1234512345 Días de cultivo y resultados 1234567 Conclusión Observaciones Revisor: Inspector: