Este artículo describe brevemente la investigación y aplicación de biosensores, especialmente sensores microbianos, en la industria de la fermentación y los campos de monitoreo ambiental en los últimos años, y analiza sus perspectivas de desarrollo. y comercialización. Previsiones y Outlook. El bioelectrodo es un material sensible que utiliza organismos inmovilizados como elementos de reconocimiento molecular. Forma un biosensor con electrodo de oxígeno, electrodo de membrana y electrodo de combustible. Ha sido ampliamente utilizado en la industria de la fermentación, el control ambiental, el control de alimentos, la medicina clínica y otros campos. El biosensor tiene buena especificidad, operación simple, equipo simple, medición rápida y precisa y un amplio rango de aplicaciones. Con el desarrollo de la tecnología de inmovilización, los biosensores son extremadamente competitivos en el mercado.
Palabras clave: biosensor; industria de la fermentación; monitoreo ambiental.
1. Introducción
Han pasado 40 años desde que Clark y Lyons propusieron por primera vez la idea de los biosensores en 1962. Los biosensores han sido ampliamente valorados y aplicados en campos como la tecnología de fermentación, la monitorización ambiental, la ingeniería alimentaria, la medicina clínica y la medicina militar. En los primeros 15 años, los biosensores se basaron principalmente en el desarrollo de electrodos enzimáticos. Sin embargo, debido a que esta enzima es costosa e inestable, su aplicación como material sensible es limitada.
En los últimos años, con el continuo desarrollo de la tecnología de inmovilización microbiana, se han producido electrodos microbianos. En comparación con los electrodos enzimáticos, los electrodos microbianos son únicos porque utilizan microorganismos vivos como elementos de reconocimiento molecular. Puede superar las deficiencias del alto precio, la dificultad de extracción y la inestabilidad. Además, también podemos utilizar coenzimas en microorganismos para manejar reacciones complejas. En la actualidad, la aplicación de biosensores de fibra óptica está cada vez más extendida. Con el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa, deberíamos
cada vez más biosensores de ADN utilicen PCR.
2. Estado de la investigación y principales campos de aplicación
1. Industria de la fermentación
Entre varios biosensores, los sensores microbianos son los más adecuados para la detección en la industria de la fermentación. Dado que durante el proceso de fermentación a menudo existen sustancias que interfieren, el caldo de fermentación a menudo no es claro ni transparente y no es adecuado para la medición espectral. La aplicación de sensores microbianos tiene el potencial de eliminar interferencias y no está limitada por la turbidez del caldo de fermentación. Al mismo tiempo, dado que la industria de la fermentación es una producción a gran escala, los sensores microbianos tienen grandes ventajas debido a su bajo costo y equipo simple.
(1).Determinación de materias primas y metabolitos
Se pueden utilizar sensores microbianos para determinar materias primas como melaza y ácido acético, así como cefalosporinas, ácido glutámico y ácido fórmico. , metano, alcohol, Metabolitos como la penicilina y el ácido láctico. El principio de medición consiste básicamente en un electrodo microbiano adecuado y un electrodo de oxígeno. El oxígeno se consume mediante asimilación por parte de microorganismos, y la disminución de oxígeno se mide midiendo los cambios en la corriente del electrodo de oxígeno para medir la concentración del sustrato.
La medición de glucosa en diversas materias primas es particularmente importante para el control del proceso. Utilizando el metabolismo y el consumo de glucosa por Pseudomonas fluorescens, se puede estimar la concentración de glucosa mediante la detección de electrodos de oxígeno. Este electrodo microbiano tiene resultados de medición similares en comparación con el tipo de electrodo de enzima de glucosa, que tiene alta sensibilidad, buena repetibilidad y practicidad, y no requiere el uso de costosas enzimas de glucosa.
Cuando se utiliza ácido acético como fuente de carbono para cultivos microbianos, un contenido de ácido acético superior a una determinada concentración inhibirá el crecimiento de microorganismos, por lo que se requiere una medición en línea. La concentración de ácido acético se puede medir mediante un sensor microbiano que consta de levadura inmovilizada, una membrana permeable a los gases y un electrodo de oxígeno.
Además, la combinación de E. coli con un sensor de gas de dióxido de carbono puede formar un sensor microbiano para la determinación de glutamato, y toda la célula de la bacteria Citrobacter se fija en una membrana de colágeno. Para la determinación de cefalosporinas en caldo de fermentación se puede utilizar un sensor microbiano compuesto por un reactor de membrana de bacterias y colágeno y un electrodo de vidrio combinado.
(2) Determinación del número total de células microbianas
En términos de control de la fermentación, siempre ha existido la necesidad de un método simple y continuo para medir directamente el número de células. . Se descubrió que las bacterias pueden oxidarse directamente generando una corriente eléctrica en la superficie del ánodo. Este sistema electroquímico se ha aplicado a la determinación del número de células y los resultados son los mismos que los del método tradicional de recuento de placas [1].
(3) Identificación de pruebas metabólicas
La identificación tradicional de tipos metabólicos microbianos se basa en el crecimiento de microorganismos en un determinado medio de cultivo. Estos métodos experimentales requieren largos tiempos de incubación y técnicas especiales. La asimilación de sustratos por parte de los microorganismos se puede medir por su actividad respiratoria. Los electrodos de oxígeno pueden medir directamente la actividad respiratoria de los microorganismos. Por tanto, se pueden utilizar sensores microbianos para medir las propiedades metabólicas de los microorganismos. El sistema ha sido utilizado para identificación simple de microorganismos, selección de medios de cultivo microbianos, determinación de actividad enzimática microbiana, estimación de sustancias biodegradables en aguas residuales, selección de microorganismos para tratamiento de aguas residuales, prueba de asimilación de lodos activados, determinación de sustancias biodegradables Determinación y selección de métodos de conservación microbiana [2].
2. Monitoreo ambiental
(1). Determinación de la demanda bioquímica de oxígeno.
La medición de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) tiene como objetivo monitorear la contaminación del agua. cuerpos por materia orgánica El indicador más utilizado. La medición convencional de DBO requiere un período de incubación de 5 días, es compleja, repetitiva, requiere mucho tiempo y es laboriosa, y no es adecuada para el monitoreo in situ. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un nuevo método que sea simple de operar, rápido, preciso, altamente automatizado y ampliamente utilizado. Actualmente, los investigadores han aislado dos nuevas especies de levadura, SPT1 y SPT2, y las han fijado en electrodos de carbón vítreo para formar un sensor microbiano para medir la DBO con una repetibilidad dentro de 10. Este sensor se utiliza para medir DBO en aguas residuales de plantas de celulosa. El valor mínimo de medición es 2 mg/l y el tiempo es de 5 minutos [3]. También existe un nuevo tipo de sensor microbiano que utiliza cepas de levadura resistentes a alta presión osmótica como materiales sensibles y puede funcionar normalmente bajo alta presión osmótica. Además, esta cepa se puede almacenar seca durante mucho tiempo y su actividad se restablecerá después del remojo, lo que proporciona un método rápido y sencillo para la determinación de DBO en agua de mar [4].
Además de los sensores microbianos, también se han desarrollado biosensores de fibra óptica para determinar valores más bajos de DBO en el agua de los ríos. El tiempo de respuesta del sensor es de 65438±05 minutos, y las condiciones óptimas de trabajo son 30°C y pH=7. El sistema de sensores casi no se ve afectado por iones de cloruro (dentro del rango de 1000 mg/l) y metales pesados (Fe3, Cu2, Mn2, Cr3, Zn2). Este sensor se utilizó para medir la DBO en agua de río y logró buenos resultados [4].
Actualmente existe un biosensor de DBO cuya sensibilidad ha mejorado mucho después del tratamiento con luz (es decir, utilizando TiO2 como semiconductor e irradiándolo con una lámpara de 6 W durante unos 4 minutos), lo cual es muy adecuado. para la determinación de baja DBO en agua de río [5]. Al mismo tiempo, se desarrolló un biosensor óptico compacto que puede medir los valores de DBO de varias muestras simultáneamente. Utiliza tres pares de diodos emisores de luz y fotodiodos de silicio, con Pseudomonas inmovilizadas en el fondo del reactor mediante resina fotorreticulada. Este método de medición es rápido y sencillo, se puede utilizar durante seis semanas a 4°C y se ha utilizado en procesos de tratamiento de aguas residuales de fábricas [5].
(2) Determinación de diversos contaminantes
Los indicadores de contaminación importantes de uso común incluyen amoníaco, nitrito, sulfuro, fosfato, carcinógenos y mutágenos, e iones de metales pesados, compuestos fenólicos, tensioactivos y otros. sustancias. Actualmente, se han desarrollado y puesto en aplicaciones prácticas varios biosensores para medir diversos contaminantes.
Los sensores microbianos que miden el nitrógeno y el nitrato amoniacal están compuestos principalmente por bacterias nitrificantes aisladas de equipos de tratamiento de aguas residuales y electrodos de oxígeno. Actualmente, existe un sensor microbiano que mide nitratos y nitritos (óxidos de nitrógeno-) tanto en condiciones de luz como de oscuridad, y la medición en un ambiente salino hace que no se vea afectado por otros tipos de óxidos de nitrógeno. Se utiliza para medir óxidos de nitrógeno en estuarios con buenos resultados [6].
La determinación de sulfuro es un sensor microbiano hecho de Thiobacillus thiooxidans, autótrofo y aeróbico especializado, aislado y cribado del suelo ácido cerca de la pirita. Cuando el pH = 2,5, la actividad se mide más de 200 veces por semana a 31°C y la actividad permanece sin cambios, pero disminuye en 20 veces después de dos semanas. La vida útil del sensor es de 7 días. El equipo es sencillo, económico y fácil de operar. Actualmente se utilizan electrodos microbianos para medir el contenido de sulfuros y las bacterias utilizadas son la cromatina. SP, conectado al electrodo de hidrógeno [7].
Recientemente, los científicos aislaron una bacteria que emite fluorescencia en áreas contaminadas.
Esta bacteria contiene un gen fluorescente que puede producir proteínas fluorescentes cuando es estimulada por fuentes de contaminación, emitiendo así fluorescencia. Este gen se puede introducir en bacterias adecuadas mediante ingeniería genética para fabricar sensores microbianos para el seguimiento ambiental. Se ha introducido luciferasa en Escherichia coli para la detección de compuestos tóxicos de arsénico [8].
Se han logrado grandes avances en la determinación de fenoles y tensioactivos en agua. Actualmente, se han aislado nueve especies de bacterias gramnegativas del suelo de la cuenca petrolera de Siberia Occidental y el fenol es la única fuente de carbono y energía. Estas cepas pueden mejorar la sensibilidad de la porción receptora del biosensor. Su límite de monitoreo para fenol es de 5 a 10-9 moles. Las mejores condiciones de trabajo del sensor son: pH=7,4, 35 ℃ y el tiempo de trabajo continuo es de 30 h [9]. También se cuenta con un biosensor amperométrico para medir la concentración de tensioactivos producidos por Pseudomonas spp. Las células microbianas se fijan en geles (agar, agarosa y alginato de calcio) y membranas de alcohol polietílico. La reticulación de las células microbianas en el gel causada por el papel de prueba cromatográfico GF/A o el aldehído del ácido glutámico se puede utilizar en altas distancias. superficies de concentración. El agente activo mantiene su actividad y crecimiento durante la detección. El sensor puede restaurar rápidamente la actividad del elemento sensible después de la medición [10].
También existe un biosensor amperométrico para medir pesticidas organofosforados que utiliza enzimas artificiales. Usando hidrolasa del pesticida organofosforado, el límite de detección de p-nitrofenol y dietilfenol es de 100?10-9mol, y es de solo 4 minutos a 40 ℃ [11]. También hay un biosensor de fosfato recientemente desarrollado que utiliza piruvato oxidasa G combinado con el sistema automatizado de computadora de escritorio CL-FIA para detectar (32 ~ 96). Se pueden utilizar 10-9 moles de fosfato durante más de dos semanas a 25°C con alta repetibilidad [12].
Recientemente, un nuevo sensor microbiano utiliza células bacterianas como componentes biológicos para medir el contenido de nonilfenol-NP-80e en aguas superficiales. Se utiliza un electrodo de oxígeno de tipo corriente como sensor y las células microbianas se fijan en la membrana de diálisis del electrodo de oxígeno. El principio de medición es medir la actividad respiratoria de las células de Trichosporon. El tiempo de reacción de este biosensor es de 15 a 20 minutos y la vida útil es de 7 a 10 días (cuando se utiliza para mediciones continuas). Dentro del rango de concentración de 0,5 ~ 6,0 mg/l, la señal eléctrica tiene una relación lineal con la concentración de NP-80E, que es muy adecuado para la detección de tensioactivos moleculares en aguas superficiales contaminadas [13].
Además, no se puede ignorar la determinación de las concentraciones de iones de metales pesados en las aguas residuales. En la actualidad, basado en microorganismos inmovilizados y tecnología de medición de bioluminiscencia, se ha diseñado con éxito un completo sistema de monitorización y análisis para medir la biodisponibilidad de iones de metales pesados. Se introdujo un operón de Vibrio fischeri en Alcaligenes eutrophus (AE 1239) controlado por un promotor inducible por cobre. Los iones de cobre indujeron a las bacterias a emitir luz y el grado de luminiscencia fue proporcional a la concentración de iones. Al incorporar microorganismos y fibras ópticas en una matriz polimérica, se puede obtener un biosensor con alta sensibilidad, buena selectividad, amplio rango de medición y gran estabilidad de almacenamiento. En la actualidad, este sensor microbiano puede alcanzar una concentración mínima de medición de 1? 10-9 mol.
También hay un sensor microbiano amperométrico para medir iones de cobre. Utiliza cepas recombinantes de Saccharomyces cerevisiae como elementos biológicos, que fusionan el promotor inducible por iones de cobre del gen CUP1 de Saccharomyces cerevisiae con el gen lacZ de E. coli. Su principio de funcionamiento es inducir primero el promotor de CUP1 con Cu2 y luego utilizar lactosa como sustrato para la medición. Si Cu2 está presente en la solución, estas bacterias recombinantes pueden utilizar la lactosa como fuente de carbono, provocando cambios en la demanda de oxígeno de estas células aeróbicas. ¿Este biosensor se puede utilizar en el rango de concentración (0,5 ~ 2)? Determinación de soluciones de sulfato de cobre en el rango de 10-3mol. En la actualidad, se han transferido varios promotores inducibles por iones metálicos a E. coli para hacer que E. coli brille en soluciones que contienen varios iones metálicos. La concentración de iones de metales pesados se puede determinar de acuerdo con su intensidad de luminiscencia, y el rango de medición puede ser de nanomolar a micromolar, y el tiempo requerido es de 60 ~ 100 min [15] [16].
También se ha desarrollado con éxito un biosensor para medir la concentración de zinc en aguas residuales. Se utilizó la bacteria alcalina Alcaligenes para determinar la concentración y biodisponibilidad de zinc en aguas residuales, y los resultados fueron satisfactorios [17].
El sensor de algas utilizado para estimar la contaminación de los efluentes estuarinos está compuesto por la cianobacteria Spirlina subsalsa y un sensor de gas. Al monitorear el grado de inhibición de la fotosíntesis, se pueden estimar los cambios en la toxicidad del agua causados por la presencia de contaminantes ambientales. Utilizando agua natural estándar como medio, se pueden medir diferentes concentraciones de tres contaminantes principales (metales pesados, herbicidas y pesticidas carbamatos) y se pueden monitorear sus reacciones tóxicas, con alta repetibilidad y reproducibilidad [18].
En los últimos años, debido al rápido desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su amplia aplicación en la monitorización ambiental, muchos científicos han comenzado a combinarla con la tecnología de biosensores. Existe un biosensor piezoeléctrico de ADN que utiliza tecnología PCR y que puede identificar una toxina bacteriana específica. La sonda biotinilada se fija sobre el cristal de estreptomicina cargado en la superficie de platino y se pueden utilizar de 1 a 10-6 moles de ácido clorhídrico para realizar mediciones cíclicas en la misma superficie del cristal. Las muestras de ADN extraídas de bacterias se sometieron a la misma reacción de hibridación y se amplificaron mediante PCR. El producto era un fragmento genético específico de Aeromonas hydrophila. Este biosensor piezoeléctrico puede identificar si una muestra contiene este gen, lo que permite detectar si las muestras de agua contienen varias especies de Aeromonas que albergan este patógeno [19].
También existe un biosensor de canal que puede detectar sustancias tóxicas como las neurotoxinas dinoflageladas producidas por organismos como el fitoplancton y las medusas. Se han podido medir cantidades muy pequeñas de toxinas PSP contenidas en las células del plancton[20]. . También se están adoptando rápidamente sensores de ADN. Actualmente, existe un biosensor de ADN miniaturizado que puede convertir señales de reconocimiento de ADN en señales eléctricas para medir Cryptosporidium y otros agentes infecciosos transmitidos por el agua en muestras de agua. Este sensor se centra en mejorar la función de reconocimiento de los ácidos nucleicos, mejorar la especificidad y sensibilidad del sensor y buscar un nuevo método para convertir señales de hibridación en señales útiles. El trabajo de investigación actual se centra en la integración de dispositivos de identificación y dispositivos de conversión [21].