La ubicación del ADN se determina mediante tinción con tintes fluorescentes que pueden detectar hasta 20 pg de ADN bicatenario examinando el gel bajo luz ultravioleta. Los geles de agarosa tienen una resolución más baja que los geles de poliacrilamida pero tienen una gama más amplia de separaciones. ?En este proceso, se puede separar ADN desde 50 pb hasta varias megabases en un gel de agarosa (50-20.000 pb es óptimo).
La agarosa es un polímero lineal que contiene d?- y l-galactosa alternadas unidas por enlaces α(1-3) y β(1-4) en las posiciones 3 y 6. Hay un puente de deshidratación entre ellas. Se gelifica para formar una rejilla tridimensional de canales con tamaños que van desde 50 a ≥200 nm. La tasa de migración de una muestra de ADN depende de varios factores descritos en el capítulo anterior. Un factor es el tamaño de la muestra de ADN.
La electroforesis en gel de agarosa es un método de electroforesis en gel utilizado en bioquímica, biología molecular, genética y química clínica para separar poblaciones mixtas de macromoléculas como ADN o proteínas en una matriz de agarosa, uno de los dos componentes principales. de agar. Las proteínas se pueden separar por carga y/o tamaño (la electroforesis en agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño), mientras que los fragmentos de ADN y ARN se pueden separar por longitud.
La separación de biomoléculas mediante la aplicación de un campo eléctrico mueve las moléculas cargadas a través de una matriz de gel de agarosa, donde se separan las biomoléculas por tamaño.
El gel de agarosa es fácil de moldear y tiene relativamente pocos grupos cargados, lo que lo hace particularmente adecuado para separar ADN en el rango de tamaño más común en los laboratorios, razón por la cual se usa ampliamente. El ADN aislado se puede visualizar con tinciones, más comúnmente bajo luz ultravioleta, y los fragmentos de ADN se pueden extraer del gel con relativa facilidad. La mayoría de los geles de agarosa utilizados se disuelven entre un 0,7 y un 2 % en un tampón de funcionamiento adecuado.
Características
Gel de agarosa moldeado en bandejas para uso en electroforesis en gel. El gel de agarosa es una matriz tridimensional compuesta de moléculas de agarosa helicoidales en haces superhélices que se agregan en estructuras tridimensionales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. ?
La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede destruirse calentándola nuevamente al estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura del gel, teniendo el gel de agarosa una temperatura de gel de 35-42°C y una temperatura de fusión de 85-95°C, dependiendo de la fuente. También se encuentran disponibles agarosa de bajo punto de fusión y de bajo gel elaboradas mediante modificación química.
El gel de agarosa tiene un tamaño de poro grande y una buena resistencia del gel, lo que lo hace adecuado como medio anticonvección para la electroforesis de ADN y moléculas de proteínas grandes. Se estima que el tamaño de poro de un gel al 1 % es de 100 nm a 200-500 nm, y su resistencia del gel permite diluirlo al 0,15 % para formar placas de electroforesis en gel.
Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1-0,2%) son quebradizos y, por tanto, difíciles de manipular. Los geles de agarosa tienen menos poder de resolución del ADN que los geles de poliacrilamida, pero tienen un rango de separación mayor y, por lo tanto, se utilizan para fragmentos de ADN que suelen tener un tamaño de 50 a 20 000 pb.
También se puede utilizar para separar proteínas de gran tamaño y es la matriz de elección para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm. El gel de agarosa al 0,9% tiene poros lo suficientemente grandes como para que entre el bacteriófago T4.
Los polímeros de agarosa contienen grupos cargados, concretamente piruvato y sulfato. ?Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso llamado electroendotosis (EEO), retardando así el movimiento del ADN y provocando que las bandas se desdibujen. Los geles de mayor concentración tendrán un mayor flujo electroosmótico.