El Premio Nobel de Química 2020 fue otorgado a Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier por sus resultados de investigación en la tecnología de edición genética CRISPR. Antes del desarrollo de la tecnología CRISPER-Cas9, las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) de primera generación y las nucleasas efectoras activadoras de la transcripción (TALEN) de segunda generación se utilizaban ampliamente. El principio de los tres es inducir roturas de doble cadena (DSB) en la secuencia del genoma y luego corregirlas mediante mecanismos de reparación endógenos, logrando así el propósito de la edición de genes, como la eliminación, inserción y mutación de fragmentos de genes.
El intercambio de secuencias genómicas endógenas con moléculas de ADN de donantes exógenos mediante recombinación homóloga (HR) se conoce desde hace décadas. El difunto Oliver Smithies fue el primero en explicar cómo las moléculas de ADN homólogas se recombinan y se insertan correctamente en ubicaciones específicas de los cromosomas de los mamíferos. Por ello, Smith, junto con Mario Capecchi y Martin Evans, ganó el Premio Nobel de Medicina Fisiológica en 2007. ?
En 2009, los científicos utilizaron la tecnología ZFN para crear por primera vez la primera rata con genes knockout del mundo. En 1996, la tecnología ZFN se desarrolló vigorosamente. Al transformar los dominios estructurales de las ZFN, las ZFN pueden diseñarse artificialmente para reconocer ADN específico y unirse a secuencias de ADN diana. Luego, la endonucleasa FOKI puede cortar las dobles hebras de ADN para formar DSB y, finalmente, completar la autorreparación del ADN. Esta tecnología se caracterizó por un diseño simple y una alta eficiencia durante el proceso de desarrollo. Sin embargo, con el desarrollo de la ciencia, la gente descubrió que tiene un ciclo largo y es fácil no alcanzar el objetivo. y alta citotoxicidad.
Como alternativa a las ZFN, la tecnología de edición de genes de segunda generación TALEN entrará en un período de rápido desarrollo en 2021. En 2012, la revista Science incluyó a Talen Technology como uno de los diez principales avances científicos del año. El nombre completo de TALEN es efector similar a un activador de la transcripción, que se deriva de bacterias patógenas de plantas. El principio fundamental de la tecnología Talen es identificar secuencias en ambos lados del objetivo a través de dos Tales. Cada TALE se fusiona con un dominio de endonucleasa FokI; FokI forma un objetivo de escisión del dímero a través de TALE, induce roturas de doble cadena, promueve el proceso de autorreparación del ADN y, en última instancia, logra el propósito de la edición de genes. TALEN tiene las ventajas de un diseño técnico flexible y una fuerte especificidad de reconocimiento.
Las ZFN utilizan 30 aminoácidos para formar un dominio de reconocimiento de ADN correspondiente a tres bases, mientras que las proteínas TALE utilizan 34 aminoácidos para formar un dominio de reconocimiento de ADN correspondiente a exactamente una base. Además, en comparación con la tecnología ZFN, TALE tiene una ventaja decisiva: puede modularizarse. Al eliminar, agregar y combinar libremente diferentes proteínas TALE, se pueden posicionar fácilmente fragmentos de ADN y acortar el ciclo de edición de genes. Las secuencias de ADN que los virus pueden transportar están limitadas por la transfección o electroporación con lipofectamina. Cuando la infección viral proporciona ADN extraño para la terapia génica, la eficiencia de la transfección debe ser inversamente proporcional al tamaño de la proteína. Por lo tanto, un TALE excesivamente grande sin duda provocará una reducción del ADN. en la eficiencia de corte. Además, esta tecnología también tiene las mismas deficiencias que las ZFN, incluida una alta tasa de detección fallida y una alta citotoxicidad.
Sin embargo, los científicos desarrollaron rápidamente una nueva generación de tecnología de edición de genes que es más eficiente y rápida que las dos generaciones anteriores. Precisa y de bajo costo, también conocida como tecnología CRISPR/Cas9, consiste principalmente en secuencias repetidas palindrómicas cortas agrupadas CRISPR y endonucleasa contable Cas9. El mecanismo molecular del sistema CRISPR/Cas9 se reveló en 2011. En 2014, la bioquímica estadounidense Jennifer explicó por primera vez el principio de funcionamiento del sistema CRISPR/Cas9 y demostró que puede encontrar la secuencia de ADN correspondiente y cortarla según la guía de un ARN guía (ARNg).
El principio de funcionamiento del sistema CRISPR/Cas9 es que el ARNcr se combina con el ARN TRAC mediante el emparejamiento de bases para formar un complejo ARN TRAC/ARNcr, que guía a la proteína nucleasa Cas9 para escindir el ADN bicatenario en el sitio objetivo de la secuencia emparejado con el ARNcr. Se diseñaron artificialmente dos tipos de ARN, crRNA y tracrRNA, y se convirtieron en sgRNA con función de guía, guiando así a Cas9 para cortar el ADN en un sitio fijo. Poco después, el biólogo chino Feng Zhang, del MIT, demostró que este sistema también podría utilizarse en células de mamíferos. El sistema CRISPR/Cas9 es un sistema de defensa natural único de bacterias y arqueas, que se utiliza para resistir la invasión de virus o partículas extrañas. Cuando un gen extraño invade, la secuencia CRISPR del sistema de defensa expresará un ARN que es diferente de la secuencia del genoma invasor, y luego la enzima relacionada con CRISPR corta el ADN genómico extraño en el sitio de reconocimiento de la secuencia para lograr propósitos de defensa. ?
Principios de la tecnología CRISPR/Cas9
1. El sgRNA se combina con la proteína Cas9 para formar un complejo RNP.
2. El complejo RNP se posiciona en el sitio objetivo del genoma bajo la guía del sgRNA.
3. La proteína Cas9 corta las dobles hebras del ADN en el sitio objetivo, lo que produce roturas de doble hebra (DSB).
4.4. Mecanismo que provoca la reparación de emergencia de las células. DSB: reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o reparación de recombinación homóloga (HDR).
5. En la mayoría de los casos (>80), las células utilizan la vía de reparación NHEJ para eliminar o insertar aleatoriamente bases individuales en el sitio objetivo para obtener el gen knockout Indel.
6. En casos raros (
7. Al introducir fragmentos de genes extraños o bases mutadas en fragmentos homólogos, se puede utilizar un modelo de inserción dirigida al sitio de un gen o un modelo de mutación dirigida al sitio de un gen. ser obtenido
En los últimos años, la tecnología de edición de genes CRISPR/Cas se ha desarrollado rápidamente, involucrando aplicaciones en biología, medicina, agricultura y medio ambiente. En 2017, Yang Luhan aplicó la tecnología de edición de genes CRISPR/Cas a CAR. -T se publicó un artículo en la revista Science que utiliza la tecnología CRISPR/Cas9 para eliminar la secuencia del retrovirus endógeno (PERV) en el genoma del cerdo. Ese mismo año, el académico Yuan Longping, padre del arroz híbrido, anunció su uso. de la tecnología CRISPR/Cas9 para eliminar el cadmio en el arroz.
Hasta ahora, la tecnología CRISPR/Cas9 ha logrado nuevos avances en comparación con las dos generaciones anteriores de tecnología de edición de genes. La tecnología Cas9 tiene mayor eficiencia de corte y mayor conveniencia. Los TALEN requieren cientos de bases para completar el ensamblaje del sistema de posicionamiento, mientras que CRISPR solo requiere un fragmento de ARNg que corresponde al gen objetivo, y la propia proteína Cas9 tiene actividad endonucleasa y no. requiere endonucleasas adicionales, lo que proporciona una gran comodidad para el tratamiento a gran escala de enfermedades genéticas de mutación puntual en el futuro. Además, esta tecnología tiene las ventajas de un diseño simple y puede apuntar a casi cualquier secuencia celular. Durante la exploración, Haixing ha desarrollado una tecnología libre de virus que construye un plásmido del sistema de transposones para transfectar plásmidos en células, lo que ahorra de 3 a 4 veces. En comparación con los métodos virales tradicionales, el precio también se ahorra alrededor de 40. Con el desarrollo de la tecnología de edición de genes, Haixing seguirá el ritmo del desarrollo tecnológico y protegerá su investigación científica.
Referencia
Kno. Te GJ. CRISPR-Cas conduce al futuro de la ingeniería genética 31 de agosto de 2018;361(6405):866-869.doi:10.1126/science.aat 5011. -Ospina N, Porteous MH. La edición genética ocupa un lugar central.
2065 438 08 agosto;34(8):600-611.doi:10.1016/j.TIG.2018.05.004.
La historia de la edición del genoma de los mamíferos. Genoma de mamíferos. 28(7-8):237-246.doi:10.1007/s 00335-017-9699-2.