Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AT-MT). Agrobacterium tumeficiens puede infectar plantas en el lugar lesionado, transferir el ADN-T (ADN de transferencia) de su plásmido Ti a las células vegetales e integrarlo en el genoma de la planta. De acuerdo con esta característica de Agrobacterium, la transformación de células vegetales mediada por Agrobacterium tumefaciens se ha convertido en un método de transformación genética de uso común. Además de transformar células vegetales, ATMT ha transformado con éxito levaduras, hongos filamentosos y células animales. Para la transformación de hongos filamentosos, el método tradicional de transformación de hongos filamentosos requiere la preparación de protoplastos, mientras que la transformación de hongos filamentosos por ATMT puede utilizar directamente esporas, hifas, etc. como receptores de transformación, facilitando la operación. Por lo tanto, ATMT se utiliza cada vez más en la transformación de hongos filamentosos y también se ha utilizado en la transformación genética de Trichoderma. Se ha convertido en uno de los métodos de transformación más utilizados para transformar el hongo Trichoderma.
8.1.5.1 Principio de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
El principio de transformación de hongos como Trichoderma mediada por Agrobacterium tumefaciens es básicamente el mismo que el principio de transformación de plantas. Los estudios han demostrado que la transformación genética de hongos filamentosos como Trichoderma mediada por Agrobacterium tumefaciens también requiere la expresión de genes vir. En la actualidad, se han estudiado en profundidad la transcripción y los mecanismos reguladores de genes relacionados implicados en la transferencia de genes extraños en la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Entre ellos, la expresión del gen de toxicidad vir en el plásmido Agrobacterium Ti es necesaria para completar la transformación genética. Bajo la acción de algunos compuestos fenólicos, como la acetosiringona, se induce la expresión del gen vir en el plásmido Ti y se sintetizan algunas proteínas necesarias para la transferencia del ADN-T. Los productos proteicos que codifican participan en la síntesis, procesamiento y transferencia del ADN-T monocatenario.
Entre ellos, VirA y VirG son proteínas reguladoras con expresión constitutiva de bajo nivel. Cuando inductores como compuestos fenólicos como la acetosiringona están presentes en el mundo exterior, VirA y VirG producidos por vir Dual pueden activarse. sistema de control. En presencia de monosacáridos específicos, la proteína ChvE expresada por el gen cromosómico interactúa con VirA para mejorar aún más el nivel de expresión del gen vir. VirA es una proteína incrustada en una membrana que puede fosforilarse automáticamente bajo la acción de la acetosiringona. La VirG activada es una proteína de unión al ADN que, como activador de la transcripción, puede activar aún más la expresión de sus propios genes y otros genes en la región vir. .
El ADN-T se transfiere a la célula receptora en forma de una sola hebra. Por tanto, el primer paso es la síntesis y procesamiento del ADN-T monocatenario, en el que codifican los productos VirD1 y VirD2. por VirD están involucrados. Con la ayuda de VirD1, VirD2 puede unirse a sitios específicos en las secuencias repetidas del borde en ambos lados del ADN-T y cortarlo para crear una mella, terminando en la secuencia repetida del borde izquierdo. Hay una secuencia conductora fuerte de 25 pb cerca de la secuencia repetida del borde derecho, donde la proteína VirC1 se une y también estimula la producción de cadenas simples de ADN-T. Posteriormente, bajo la acción de la ADN polimerasa, el ADN-T monocatenario se replica en el espacio. Cuando la replicación continúa a otro espacio, el ADN-T se libera y se combina con VirD2 para formar un complejo VirD2/ADN-T.
Una vez formada la hebra única, el ADN-T atravesará la membrana celular bacteriana y la pared celular a través del mecanismo de secreción tipo IV. En este proceso participan las proteínas VirB y VirD4. Los productos codificados por VirB forman poros de transporte y estructuras de pilus T en la superficie de las bacterias. El producto codificado por virD, VirD4, es una proteína incluida en la membrana que media la interacción entre el complejo VirD2/T-DNA y el complejo proteico VirB. El complejo compuesto por VirD2/T-DNA y VirE2 y VirE3 se transporta fuera de las bacterias a través del mecanismo de secreción tipo IV.
En la actualidad, el mecanismo por el cual los complejos de ADN-T monocatenarios ingresan a las células receptoras aún no está claro, pero existe una comprensión preliminar del mecanismo de transferencia desde el citoplasma del receptor al núcleo. Estas dos proteínas desempeñan un papel clave en guiar el ADN-T hacia el núcleo de la célula receptora. Entre ellas, VirD2 contiene la secuencia señal de localización nuclear NLS, que puede interactuar con la proteína perinuclear A de la célula huésped (carioferina) y transferirse a la célula receptora. núcleo. Al mismo tiempo, VirE3 también puede unirse a la proteína perinuclear A en la célula receptora y ser transportado al núcleo de la célula receptora a través de una vía dependiente de la proteína perinuclear A, guiando así el complejo de ADN-T hacia el núcleo. Una vez dentro del núcleo celular, el ADN-T puede integrarse de forma estable en el genoma. El mecanismo específico de integración del ADN-T aún no está claro, pero las proteínas del huésped deberían desempeñar un papel importante (Caroline et al., 2005).
8.1.5.2 Pasos de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
(1) Construcción del vector binario. El sistema de vector de expresión binario es en realidad un plásmido. El vector binario contiene dos partes, una parte es el ADN-T que se puede transferir y la otra es la región Vir que puede ayudar a la transferencia del ADN-T. La región de transferencia tiene límites izquierdo y derecho. Generalmente, entre las dos secuencias límite del ADN-T se inserta un gen de resistencia que contiene un promotor y terminador fúngico adecuado, como por ejemplo el gen de la higromicina B fosfotransferasa. y derechos, y sólo la región de ADN-T dentro de los límites izquierdo y derecho se integrará en el genoma del huésped. Los vectores de expresión binarios se pueden transformar en Agrobacterium tumefaciens mediante el método de congelación-descongelación, apareamiento de tres padres o transformación por descarga eléctrica (cepa donante de E. coli, cepa auxiliar de Escherichia coli, cepa receptora de Agrobacterium tumefaciens). Según diferentes propósitos, los vectores binarios construidos se pueden dividir en dos tipos: tipo de inserción aleatoria y vector plasmídico de tipo de inserción de gen diana. El vector plasmídico del tipo de inserción del gen diana necesita conectar un fragmento de ADN de longitud apropiada que sea homólogo a la secuencia del gen diana en ambos extremos del gen de resistencia y provoque mutaciones en el gen diana mediante recombinación homóloga. Para la clonación de genes, también se pueden insertar vectores de clonación apropiados entre las secuencias repetitivas fronterizas, y se pueden recuperar fragmentos de ADN-T y del gen diana de los transformantes usando métodos tales como rescate de plásmidos y TAIL-PCR.
(2) Activación y cultivo de Agrobacterium tumefaciens. Elija una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens que contenga el vector binario de la placa YEP e inocúlela en 7 ml de medio líquido YEP que contenga los antibióticos apropiados y cultívela a 250 r/min y 28 °C durante la noche. Al día siguiente, utilice medio de inducción IM (que contenga acetosiringona 200 mM) para diluir hasta una DO660 de 0,15 y luego continúe cultivando durante 4 a 6 horas hasta una DO660 de 0,6 a 0,8.
(3) ***Cultivo y cribado e identificación de transformantes. Mezcle 100 µL de Agrobacterium tumefaciens inducido y activado y un volumen igual de suspensión de conidias de Trichoderma y extiéndalos uniformemente en la placa de medio IM que contiene acetosiringona 200 µM, cultive a 28°C durante 48 h y luego cultive en IM. La placa base se cubre con una capa de medio PDA que contiene 100 μg/ml de higromicina (u otros antibióticos) (que contiene 50 μg/ml de tetraciclina para matar Agrobacterium tumefaciens). Continuar cultivando durante 4 a 7 días y recoger los transformantes crecidos en un medio que contenga higromicina para su detección y cultivo. Las bacterias resistentes se transfirieron al medio que contenía el fármaco y se continuaron cultivando. Se extrajo el ADN genómico y se identificaron los transformantes sospechosos y el número de copias del ADN-T insertado mediante amplificación por PCR e hibridación Southern.
8.1.5.3 Factores que afectan la eficiencia de la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens
En comparación con otros métodos de transformación, aunque ATMT tiene las características de una alta eficiencia de transformación, su eficiencia de transformación también es la mismo Afectado por muchos factores. Estos factores incluyen el tipo de cepa de Agrobacterium tumefaciens, el tipo de receptor de transformación, la concentración de Agrobacterium tumefaciens y su receptor, la concentración de acetosiringona y las condiciones ambientales del cultivo bacteriano (tiempo, temperatura, valor de pH), etc.
Los materiales receptores de ATMT provienen de una amplia gama de fuentes, no solo protoplastos, sino también esporas, micelio y tejidos del cuerpo fructífero, etc., ampliando así el alcance de la transformación fúngica mediada por Agrobacterium. Pero los hongos individuales sólo pueden transformar ciertos tipos. Por ejemplo, ATMT puede transformar con éxito Coccidioides immitis sólo utilizando esporas germinadas como material de partida, pero sólo puede utilizar protoplastos como material de partida para Rhizopus oryzae y Mucor circinelloides. Para Trichoderma, los conidios y las hifas se utilizan principalmente como objetivos de transformación. Sin embargo, la eficiencia de transformación de diferentes cepas también varía mucho.
Las cepas de Agrobacterium comúnmente utilizadas para transformar hongos incluyen AGL-1, EHA105, LBA1100, LBA4404 y C58C1. Las diferentes cepas de Agrobacterium tienen un gran impacto en la eficiencia de la transformación. Para el mismo material receptor, diferentes cepas de Agrobacterium tienen una gran influencia en la eficiencia de transformación. Por ejemplo, Kemppainen et al (2005) encontraron que para el patógeno ectomicorrízico Laccaria bicolor, Agrobacterium tumefaciens LBA1100 y AGL-1 la eficiencia de conversión difiere en 4. veces, y AGL-1 es más adecuado. Gaoxi et al. (2004) utilizaron AGL-1 y LBA4404 para transformar genéticamente T. harzianum T88 y descubrieron que LBA4404 no podía transformar T. harzianum T88, mientras que AGL-1 transformó con éxito T. harzianum T88. Con base en informes relevantes, se puede concluir que las cepas con alta virulencia de Vir tienen una eficiencia de transformación relativamente alta, y diferentes cepas y tipos de vectores también tienen efectos interactivos sobre la eficiencia de la transformación.
La acetilsiringona (AS) es el factor básico que induce la expresión de los genes de virulencia de Agrobacterium y también es un factor clave en el éxito de la transformación. Se requiere AS durante el cultivo bacteriano de Agrobacterium tumefaciens. Antes del cultivo ***, el uso de AS para inducir y cultivar Agrobacterium tumefaciens puede mejorar la eficiencia de la transformación. Entre ellos, la adición de AS en el medio de cultivo *** determina directamente el éxito de la transformación, y la concentración agregada determina el nivel de eficiencia de la transformación. No agregar AS durante el proceso de inducción conducirá a una reducción en la eficiencia de la transformación; Además, la concentración de AS en el medio de cultivo *** afectará el número de copias de inserción de ADN-T. Normalmente, una concentración demasiado alta aumentará el número de copias de inserción de ADN-T. Por ejemplo, Mullins et al. (2001) encontraron durante la transformación de Fusarium oxysporum que a medida que aumentaba la concentración de AS, también aumentaba el número de copias de inserción de ADN-T.
La concentración celular del receptor de transformación y la concentración de Agrobacterium también afectarán a la eficiencia de la transformación. A medida que aumenta la concentración de bacterias receptoras o Agrobacterium, la eficiencia de transformación mejorará significativamente. Sin embargo, existe un cierto límite para el crecimiento de los dos efectos. Un exceso de Agrobacterium provocará una reducción en la eficiencia de la transformación. Además, es difícil inhibir el crecimiento de bacterias Agrobacterium en alta concentración después del cultivo, afectando así el crecimiento de los transformantes. Si la concentración de la bacteria receptora es demasiado alta, será difícil seleccionar transformantes.
Además, las condiciones ambientales del cultivo *** (temperatura del cultivo, tiempo y valor de pH) también tienen un cierto impacto en la eficiencia de la transformación. El tiempo de cultivo *** es demasiado corto para formar transformantes. Como *** A medida que aumenta el tiempo de cultivo, el número de transformantes aumenta en consecuencia. Para Trichoderma, debido a un crecimiento demasiado rápido y un tiempo de cultivo demasiado largo, es fácil provocar colonias superpuestas, lo que generalmente no es adecuado para la selección de colonias. El mejor tiempo de cultivo se controla entre 24 y 48 horas. El efecto de la temperatura en la tasa de conversión no es tan significativo como el tiempo de cultivo. El rango de temperatura es generalmente de 20 a 37 ℃, y 22 a 25 ℃ es la temperatura óptima. A temperaturas relativamente altas (>28°C), Agrobacterium tumefaciens no puede realizar bien sus funciones. ***El valor del pH del medio de cultivo también tiene un impacto significativo en la eficiencia de la transformación. Generalmente, la eficiencia es mayor cuando el valor del pH es alrededor de 6,0. Aumentar o disminuir el valor del pH reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. En condiciones de valor de pH, la eficiencia de transformación es menor, lo que puede deberse a los efectos adversos del pH alto en la expresión de proteínas tóxicas.
Por ejemplo, Huang Yali (2008) examinó el impacto de las condiciones ambientales del cultivo bacteriano en la transformación de T. harzianum y encontró que dentro de un cierto rango, la eficiencia de la transformación aumentaba significativamente a medida que se extendía el tiempo de cultivo bacteriano y aumentaba la temperatura. Sin embargo, si el tiempo es demasiado largo y la temperatura es demasiado alta, la eficiencia de conversión disminuirá. Tomando la temperatura de transformación de 24 °C como ejemplo, la eficiencia de transformación es de 14 transformantes/107 esporas a las 24 h, 200 transformantes/107 esporas a las 36 h, y la eficiencia de transformación más alta es de 275 transformantes/107 esporas a las 48 h. El tiempo se extendió a 72 horas, las hifas de Trichoderma crecieron demasiado en la placa de cultivo bacteriano. Cuando se transfirieron a la placa resistente, apareció una gran cantidad de colonias de fondo en el medio de cultivo. Esto puede deberse a que la higromicina B no puede matar el exceso y. Hifas de Trichoderma demasiado crecidas. *** También hay un punto de inflexión en el impacto de la temperatura de conversión en la eficiencia de conversión. Cuando la temperatura es baja, la eficiencia de conversión es baja a medida que aumenta la temperatura, la eficiencia de conversión aumenta gradualmente. Al aumentar la temperatura, la eficiencia de conversión disminuirá. Esto puede deberse a que una temperatura demasiado alta o demasiado baja no favorece la función de las proteínas de virulencia de Agrobacterium. Con respecto al valor de pH, la transformación *** es óptima en un ambiente con un valor de pH de 5,3. Aumentar o disminuir el valor de pH reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. Cuando el valor de pH es superior a 6,5, casi no se producen transformantes.