Al igual que otros organismos, el azúcar es la principal sustancia energética en Trichoderma. El crecimiento de Trichoderma requiere una fuente de carbono, y la fuente de carbono más adecuada es el azúcar (consulte el Capítulo 4 para obtener más detalles). La fuente de carbono extracelular de Trichoderma se convierte en glucosa a través de diferentes vías y ingresa a la célula, y luego la glucosa se cataboliza para proporcionar la energía necesaria para el crecimiento de Trichoderma. Como se muestra en la Figura 5.1, Trichoderma puede degradar el almidón y la celulosa en el medio ambiente a través de glucoamilasa, glucanasa, celulasa, etc. para producir glucosa, o la glucosa contenida en el medio de cultivo puede ingresar a través del transporte intracelular de glucosa. un sistema de transporte activo y los sistemas de transporte de azúcar de otros hongos, como Saccharomyces cerevisiae y Neurospora crassa, han sido bien estudiados (Boles et al., 1997; Lagunas, 1993; Marger et al., 1993; Åzcan et al., 1999; Rand y otros, 1980a, 1980b). Delgado-Jarana et al. (2003) aislaron un gen que codifica un transportador de glucosa, gtt1., de T. harzianum CECT 2413. Este gen codifica glucosa que contiene 12 dominios transmembrana y varios dominios de transporte de azúcar típicos. Su expresión es inhibida por niveles elevados de glucosa y afectada por el pH, lo que indica que el transporte de glucosa en Trichoderma se ve afectado por el pH (Delgado-Jarana et al., 2003). El mutante ΔTrhxt1 de Trichoderma reesei (T.reesei) exhibe un fenotipo de acumulación de glucosa, Ramos et al (2006) aislaron un gen que codificaría un transportador de glucosa en Trichoderma reesei (T.reesei). encontraron que la expresión de este gen es inhibida por altas concentraciones de glucosa y regulada por la concentración de oxígeno (Ramos et al., 2006). Trhxt1 se expresa a niveles micromolares en ausencia de glucosa. Cuando Trichoderma reesei (T. reesei) se cultiva en medios que contienen celulosa, la degradación de la celulosa lleva la concentración de glucosa a niveles micromolares y se induce la expresión de este gen. de este gen está significativamente regulado a la baja bajo hipoxia (Ramos et al., 2006).
Figura 5.1 Síntesis y metabolismo de la glucosa
La oxidación extracelular de glucosa u otros monosacáridos se informa a menudo en otros hongos, pero aún no se ha informado en Trichoderma y Myxosporium Ver. No hay glucosa oxidasa en Trichoderma reesei (T.reesei) y Trichoderma atroviride (T.atroviride), pero la glucosa oxidasa de Aspergilus niger puede activar la enzima en Trichoderma reesei (T.atroviride) y Trichoderma reesei (T.atroviride). Expresado y activo en Trichoderma (T.reesei) (Mach et al., 2004; Mu Jingyu et al., 2006). Se ha informado que la ascorbato oxidasa se encuentra en T.lignorum, T.viride y T.hamatum (Hatsutori et al., 1994; Nakanishi, 1995).
Los microorganismos pueden utilizar diferentes fuentes de carbono y existen grandes diferencias en la selección y eficiencia de utilización de las fuentes de carbono por parte de diferentes microorganismos. Cuando está presente una fuente de carbono preferida, el metabolismo de otras fuentes de carbono se inhibe mediante un proceso complejo y riguroso conocido como represión del metabolismo del carbono. Para estudiar la represión del metabolismo del carbono en Trichoderma, se clonó el gen represor de glucosa cre1 de Trichoderma reesei (T.reesei) y Trichoderma harzianum (T.harzianum) utilizando cebadores degenerados que codifican un agente de unión al ADN de tipo C2H2 que contiene dedos de zinc. La similitud entre la proteína CRE1 y el producto codificado por el gen represor de la glucosa creA en Aspergillus nidulans (A. nidulans) es del 46%.
El promotor cre1 contiene algunos elementos de secuencia que son consistentes con los sitios de unión previamente verificados en el gen creA de Aspergillus nidulans (A.nidulans). El sitio de unión de creA/CRE1 está compuesto por dos motivos 5′-SYGGRG-3' estrechamente conectados. composición, y la inhibición directa ocurre solo en este sitio de unión dual (Cubero et al., 1994; Strauss et al., 1995; Ilmén et al., 1996; Takashima et al., 1996a, 1996b, además, fosforilación de triptófano dentro de un sitio de unión dual); La pequeña región básica conservada también regula la capacidad de unión al ADN de CRE1 (Cziferszky et al., 2002). El nivel de cre1mRNA en Trichoderma reesei (T.reesei) QM9414 se ve afectado por la fuente de carbono. En el medio que contiene glucosa, el nivel de cre1mRNA se reduce. Estos resultados indican que la expresión de cre1 puede autorregularse. Curiosamente, Trichoderma reesei (T.reesei) contiene un mutante Rut-C30 en el que se corta el gen cre1. El fragmento del gen cre1 (cre1-1) en el mutante solo codifica 95 aminoácidos que contienen un dedo de zinc y su degradación por carbono. productos La represión se libera así, su actividad permeasa de glucosa es muy baja y puede sobreproducir enzimas celulolíticas. A diferencia de QM9414, Rut-C30 puede producir ARNm de celulasa en un medio que contiene glucosa y convertir la longitud completa de cre1. puede causar inhibición por glucosa de la expresión de cbh1, lo que indica que cre1 regula la expresión de celulasa (Ilmén et al., 1996).
Se han utilizado sistemas modelo de genes en los que la represión del metabolismo del carbono inhibe la expresión para estudiar la represión del metabolismo del carbono en la mayoría de los hongos, pero se han realizado pocos estudios sobre los cambios en la expresión genética después de que se elimina la represión del metabolismo del carbono. Los mutantes knockout creA/cre1 exhiben fenotipos tales como crecimiento reducido, morfología hifal anormal y esporulación (Shroff et al., 1997; Nakari-Set?l? et al., 2009). Portnoy et al (2011) realizaron un análisis de microarrays sobre las diferencias de expresión génica entre el mutante Δcre1 y el tipo salvaje de Trichoderma reesei (T.reesei), y por primera vez realizaron un estudio integral sobre la respuesta fisiológica molecular de la represión del metabolismo del carbono fúngico. (Portnoy et al., 2011). Como se muestra en la Figura 5.2, la expresión genética se divide en diferentes grupos. Entre ellos, los genes que están altamente expresados en el mutante Δcre1 aparecen en diferentes grupos porque se ven afectados por la tasa de crecimiento: los genes que están altamente expresados en el mutante Δcre1 no se ven afectados. por crecimiento El grupo C afectado por la tasa contiene 16 genes. Los genes que se expresan altamente solo en el mutante Δcre1 con alta tasa de crecimiento son 50 genes en el grupo E y 26 genes en el grupo G. La alta expresión en el mutante Δcre1 compensa la. Efecto de supresión de la expresión por alta tasa de crecimiento, 26 genes del grupo H estaban regulados positivamente en el mutante Δcre1 de baja tasa de crecimiento. Los genes cuya expresión está suprimida en el mutante Δcre1 se pueden dividir en dos grupos: expresión inducida por una tasa de crecimiento alta (grupo F, 36 genes) y expresión inducida por una tasa de crecimiento baja (grupo D, 36 genes).
Figura 5.2 Distribución de genes entre grupos de expresión
Nota: Según los datos del chip, se divide en 9 grupos según la diferente regulación de CRE1 (inducida por CRE1, inhibida por CRE1, independiente de CRE1). El color indica el efecto de la tasa de crecimiento. Los grupos negro y gris oscuro indican genes que solo se ven afectados por tasas de crecimiento más altas. El gris oscuro (B, F, G) indica una regulación positiva de la expresión, el negro (A, E) indica una regulación negativa. de expresión, y el gris claro (D, H) indica genes cuya expresión está regulada positivamente a bajas tasas de crecimiento, y el sombreado (C) indica genes cuya expresión no se ve afectada por la tasa de crecimiento
(Portnoy et al. ., 2011)
Figura 5.2 Los genes en cada grupo incluyen síntesis de componentes celulares, defensa celular, señalización celular, transporte celular, regulación de la actividad de las proteínas, proteínas con funciones de unión, destino de las proteínas, transcripción, energía, metabolismo secundario. Metabolismo de lípidos, metabolismo del carbono, metabolismo de aminoácidos, metabolismo general, proteínas específicas, proteínas hipotéticas y otros genes relacionados.
La glucosa intracelular se cataboliza a través de la glucólisis y la vía de las pentosas fosfato (Figura 5.1, Figura 5.3). Lo siguiente se centra principalmente en la glucólisis y la vía de las pentosas fosfato se resume en dos aspectos.
5.1.2.1 Glucólisis: conversión de glucosa en piruvato
La glucólisis es una serie de reacciones que convierten la glucosa en piruvato. Las enzimas clave en esta vía son la hexoquinasa, la fosfofructoquinasa y la piruvato quinasa (. Figura 5.3). Alguien estudió la hexoquinasa y la glucocinasa en Trichoderma reesei (T.reesei) y sus posibles funciones en el catabolismo de los carbohidratos (Kubicek-Pranz et al., 1991) y descubrió que al cultivar en diferentes sustratos de fuentes de carbono, se detectaron enzimas activas sobre la glucosa y la fructosa. lo que indica que la bacteria era capaz de producir al menos una hexoquinasa y una glucoquinasa. Sin embargo, Samuels et al. (1994) utilizaron tecnología de electroforesis para detectar varias isoenzimas de Trichoderma e Hypocrea y encontraron solo una hexoquinasa. Este desacuerdo necesita mayor aclaración, pero la actividad de las dos enzimas no cambia en las cepas mutantes de Trichoderma reesei (T. reesei) Rut-C30 y F4 o F5 en las que se libera la represión del degradador de carbono (Labudova et al., 1983). no hubo cambios en las dos cepas mutantes resistentes a la 2-desoxiglucosa, lo que indica que la hexoquinasa o la glucoquinasa no tienen ningún papel en la regulación de la glucosa de Trichoderma. Estudios posteriores con Aspergillus nidulans (A. nidulans) también llegaron a conclusiones similares (Ruyter et al., 1996).
Figura 5.3 Las principales vías del metabolismo del carbono: vía de la glucólisis y vía de las pentosas fosfato
Otras enzimas glucolíticas se han estudiado a nivel genético porque estas enzimas La expresión teórica es fuerte y tiene. Valor de aplicación potencial en la construcción de herramientas de expresión. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa se ha aislado y purificado de Trichoderma koningii (T.koningii) y también se ha clonado su gen codificante (Sakai et al., 1990). Esta enzima tiene dos isoenzimas, que se diferencian por su sensibilidad al ácido koningico, un metabolito antibiótico producido por Trichoderma koningii (T.koningii). El estudio cree que la diferencia en los residuos de aminoácidos es la razón de la diferente sensibilidad de las dos enzimas al ácido kónico. Los residuos de aminoácidos de una enzima son alanina y serina en las posiciones 174 y 181, mientras que los residuos de aminoácidos de la otra. La enzima está en las posiciones 174 y 181. treonina y treonina, respectivamente (Watanabe et al., 1993). El gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa también se ha clonado de T. harzianum, y durante la esporulación inducida por la luz, los niveles de ARNm del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd) están regulados negativamente, y los niveles más bajos se encuentran en los conidióforos. y conidios (Puyesky et al., 1997). Vanhanen et al. (1989) y Goldman et al. (1992) clonaron genes que codifican la 3-fosfoglicerato quinasa de Trichoderma reesei (T. reesei) y Trichoderma viride (T. viride), respectivamente, y su secuencia del extremo 5' contiene unión conservada. sitios para el factor de control de adenosina cíclica, una proteína catalítica y el represor de degradación de carbono cre1 (Vanhanen et al., 1989; Goldman et al., 1992b). El gen pgk1 de la 3-fosfoglicerato quinasa de Trichoderma reesei (T. reesei) también contiene una secuencia de choque térmico y no responde al estrés por calor (Vanhanen et al., 1991). El gen que codifica la piruvato quinasa también ha sido clonado de Trichoderma reesei (T. reesei), y su estructura proteica es muy similar a la piruvato quinasa de Aspergillus niger (A. niger) y Aspergillus nidulans (A. nidulans) (Schindler et al. , 1993). En Trichoderma reesei (T. reesei), se encontraron de 2 a 3 bandas de piruvato quinasa en los resultados de electroforesis con isoenzimas, pero solo se encontró un gen mediante hibridación de puntos (Schindler et al., 1993).
Hay evidencia de fosforilación de la piruvato quinasa, lo que puede ser la razón por la que se encontraron dos bandas migradas electroforéticamente.
Trichoderma también puede crecer en fuentes de carbono no sacáridas. Jackson (1973) estudió la vía metabólica de degradación del alil etanol por Trichoderma viride (T. viride) y descubrió que los productos adicionales son ácido acrílico y acetato. que luego se metaboliza a piruvato, puede acumularse hasta el 50% (p/p) de la cantidad de sustrato original (Jackson, 1973). Tye et al. (1977) estudiaron el crecimiento de T. lignorum mediante cultivo continuo en medio de metanol y encontraron que la tasa de crecimiento óptima era baja (μ = 0,026) y solo podía crecer en condiciones de baja concentración de metanol (0,16%).
5.1.2.2 Vía de las pentosas fosfato
Otro catabolismo común de los carbohidratos es la vía de las pentosas fosfato (Figura 5.3). La glucosa-6-fosfato se convierte en fructosa-6-fosfato y gliceraldehídos-3-fosfato y se devuelve a la vía de la glucólisis. El principal producto de la vía de la glucólisis es el piruvato. El ciclo de las pentosas fosfato puede proporcionar azúcar pentosa para la síntesis de ácidos nucleicos y nucleótidos. También puede proporcionar NADPH para coenzimas, portadores de energía, etc., y también puede proporcionar fosfato de eritrosa (fosfato de eritrosa). ). Sintetizar aminoácidos aromáticos (Aminoácidos Aromáticos) a través de la Vía del Ácido Shikímico. La enzima clave en esta vía es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH).
Se sabe que el catabolismo fúngico de la glucosa-6-fosfato implica la vía de la glucólisis y la de las pentosas fosfato, y la proporción de ambas varía dependiendo de las necesidades de la célula. Para la vía de las pentosas fosfato, se han encontrado al menos dos isoenzimas de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa en especies de Trichoderma del grupo de ramas largas (Samuels et al., 1994), pero Stasz et al. ) encontrado en T. viride, T. harzianum, T. virens, T. koningii y Trichoderma hook (solo se detectó una enzima en cepas de T. hamatum) y T. polysporum. Stasz et al. (1988a) probaron isoenzimas de diferentes cepas, por lo que se pueden encontrar diferencias en las isoenzimas en el método. Por lo tanto, la diferencia entre sus resultados y Samuels et al. (1994) probablemente se debe a las diferentes cepas utilizadas. Neto (1993) aisló, purificó y estudió la fosfofructoquinasa 2 en la vía de la glucólisis. Esta enzima es de gran importancia en la regulación y descubrió que no está regulada por la fosforilación cíclica dependiente de adenosina, sino que solo regula la disponibilidad de sustratos. un fenómeno diferente al de la levadura pero consistente con informes anteriores en A. niger (Harmsen et al., 1992).
La vía de las pentosas fosfato es la principal fuente de NADPH, que es necesario para la síntesis de muchas biomoléculas, especialmente lípidos (Berg et al., 2002). También proporciona intermediarios para la síntesis de aminoácidos: la histidina se sintetiza a partir de ribosa-5-fosfato y la eritrosa-4-fosfato es un precursor de la síntesis de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) (Berg et al. , 2002). Por lo tanto, la vía de las pentosas fosfato juega un papel importante en la síntesis de proteínas y se considera relevante para los sistemas biológicos para la producción eficiente de proteínas. El intermediario ribosa-5-fosfato de la vía de las pentosas fosfato también es necesario para la síntesis de ácidos nucleicos y nucleótidos. La fosfoglucosa isomerasa (PGI) cataliza el segundo paso de la vía glucolítica, convirtiendo la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. Esta enzima se encuentra en la primera unión de la glucólisis y la vía de las pentosas fosfato. La inactivación de PGI hace que el flujo metabólico se desplace hacia la vía de las pentosas fosfato, lo que resulta en la producción de más NADPH.
Se encontró que una cepa mutante de PGI, pgi, en Escherichia coli produce más precursores de nucleótidos y aminoácidos (Canonaco et al., 2001). Se clonó el gen pgi en Trichoderma reesei (T.reesei) y el análisis de la base de datos de Trichoderma reesei reveló que no existen ORF homólogos (Limón et al., 2011).
5.1.2.3 Destino metabólico de la glucosa
La vía glucolítica eventualmente degrada la glucosa en piruvato y finalmente puede producir CO2, H2O y ATP a través de la respiración aeróbica, o también se puede producir ácido láctico. por la vía anaeróbica (Fig. 5.1). Los estudios han demostrado que los cambios regulatorios en genes clave controlan la entrada de piruvato, un producto de la vía de la glucólisis, en la vía aeróbica o anaeróbica en Trichoderma reesei (T. reesei) (Chambergo et al., 2002). Chambergo et al. (2002) establecieron una base de datos EST para el hongo filamentoso Trichoderma reesei (T.reesei). Derisi et al. (1997) utilizaron tecnología de chip de ADN complementario para analizar el perfil de expresión génica cuando se agotó la glucosa y lo compararon con el patrón de expresión espaciotemporal de los genes durante el proceso de fermentación de S. cerevisiae (Figura 5.4). Se eligió Trichoderma reesei (T. reesei) para este estudio porque su hábitat natural y sus necesidades nutricionales son significativamente diferentes de los de S. cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) generalmente requiere un entorno de crecimiento con alta concentración de azúcar, mientras que Trichoderma reesei (T.reesei) puede crecer en un entorno deficiente en nutrientes y utilizar hidrolasas intracelulares, como celulasas, para oxidar el entorno circundante. hidrolizado para obtener glucosa (Beguin, 1990) (Figura 5.1). El análisis de los patrones de expresión génica en Trichoderma reesei (T. reesei) tras el agotamiento de la glucosa encontró que el producto final de la vía glucolítica, el piruvato, ingresa a la vía aeróbica en lugar de anaeróbica. Además, la expresión de genes que codifican enzimas en el ciclo del ácido tricarboxílico y proteínas en la cadena de transporte de electrones se encontró en el perfil de expresión de Trichoderma reesei (T.reesei), lo que indica que la oxidación del piruvato ocurre a través del ciclo del ácido tricarboxílico, mientras que el etanol no se produce por fermentación y el acetaldehído se oxida a ácido acético en lugar de reducirse a etanol, impidiendo así la regeneración de NADH (Chambergo et al., 2002).
El oxígeno es un factor clave que determina si el piruvato entra en la vía aeróbica o en la vía anaeróbica. Al mismo tiempo, el oxígeno también afecta la expresión de genes enzimáticos clave en la vía de la glucólisis para la producción de piruvato. Bonaccorsi et al. (2006) demostraron que la hipoxia a corto plazo puede inhibir la expresión de genes enzimáticos clave en la vía de la glucólisis y compararon el contenido de azúcar de Trichoderma reesei (T. reesei) y S. cerevisiae (S. cerevisiae) en el ausencia de oxígeno. Cambios en la expresión de genes en la vía glucolítica (Bonaccorsi et al., 2006).
5.1.2.4 Vía de la gluconeogénesis
Aunque los hongos pueden utilizar una variedad de fuentes de carbono a través de la vía de la glucólisis, si los hongos crecen en un medio de ácido acético, deben sintetizarse varios carbohidratos a través de la vía de la gluconeogénesis (Figura 5.1). La gluconeogénesis se refiere al proceso de síntesis de glucosa a partir de precursores distintos del azúcar (por ejemplo, ácido láctico, aminoácidos, glicerol, etc.). La vía gluconeogénica no es una simple inversión de la vía glucolítica porque las quinasas glucolíticas (hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa) son irreversibles. La vía de la gluconeogénesis es: el piruvato se carboxila y se convierte en oxalacetato, que luego se descarboxila y fosforila mediante la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa para formar fosfoenolpiruvato, que se transforma en el resultado de una reacción reversible en la vía de la glucólisis. proporcionó la síntesis de oligosacáridos y polisacáridos (Figura 5.1).
Figura 5.4 Comparación de perfiles de expresión genética que codifican enzimas implicadas en procesos metabólicos clave en Trichoderma reesei (T.reesei) y S. cerevisiae (S.cerevisiae) cuando se consume glucosa
Nota : Los marcos de ↑ y ↓ representan respectivamente genes cuya expresión aumenta y disminuye cuando se agota la glucosa, → representa genes cuya expresión no se ve afectada, * representa genes que no han sido aislados de Trichoderma, y el gen ADH no se obtuvo en Trichoderma, pero se detectó actividad de alcohol deshidrogenasa en especies cultivadas de Trichoderma (Beutler, 1984).
Entre ellos, FBA: fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa; TPI: gliceraldehído fosfato isomerasa; TDH: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; PYK: piruvato quinasa; piruvato deshidrogenasa; ADH: alcohol deshidrogenasa; ACS: acetil-CoA sintasa; ACO: aconitasa; ; YGR: succinato tioquinasa; SDH: succinato deshidrogenasa; FUM: fumarasa; MDH: malato deshidrogenasa
(Chambergo et al., 2002)