Principios:
1. Precipitar ADN disuelto en solución de NaC1.
2. Utilizar alcohol frío para extraer ADN con pocas impurezas.
3.El ADN se tiñe de azul mediante difenilamina en un baño de agua hirviendo.
Pasos del método:
1. Extracción de material nuclear: Agitar en el sentido de las agujas del reloj, un poco más rápido y un poco más pesado. 5 minutos
2. Disolver el ADN:
3. Precipitar la sustancia viscosa que contiene ADN: 300 ml de agua destilada, agitar lentamente en sentido antihorario.
Paso 4: Filtración: Tomar una sustancia viscosa.
5. Redisolución: Agitar en el sentido de las agujas del reloj, lentamente. 3 minutos
6. Filtración: Tomar el filtrado.
7. Extrae el ADN con menos impurezas y revuelve en el sentido contrario a las agujas del reloj, un poco más lento. 5 minutos
8. Identificación del ADN: baño maría hirviendo durante 5 minutos.
Universidad
La extracción de ADN se divide en tres pasos básicos. El método específico de cada paso puede variar según el tipo de muestra, las sustancias que afectan la extracción y los pasos posteriores.
Las células se descomponen mediante molienda u ondas ultrasónicas y los lípidos de las membranas se eliminan añadiendo detergente.
Agregue proteasa, precipitación con acetato o extracción con fenol/cloroformo para eliminar proteínas en las células, como las histonas que se unen al ADN.
Precipita el ADN en etanol frío o alcohol isopropílico, porque el ADN no es soluble en etanol y se pegará. Este paso también elimina la sal.
Además, existen kits comerciales para la extracción de ADN mediante adsorción en columna.
2. División celular
Las bacterias tienen paredes celulares duras y primero deben romper las células deformadas. Hay tres métodos; ① método mecánico: tratamiento ultrasónico, trituración y homogeneización; ② método de reactivo químico: tratar las células con SDS; ③ hidrólisis enzimática: agregar lisozima o helicasa para romper la pared.
Varios métodos de 3.3. Extracción de ADN
(1). Método de sal concentrada
A. El ARN y el ADN se separan en función de sus diferentes solubilidades en el electrolito. Un método común es la extracción con cloruro de sodio 1 M. El moco de DNP obtenido se agitó con cloroformo que contenía una pequeña cantidad de octanol, se emulsionó y luego se eliminaron las proteínas mediante centrifugación. En este momento, el gel de proteínas permanece entre la fase acuosa y la fase de cloroformo, mientras que el ADN se encuentra en la fase acuosa superior. La sal sódica del ADN se puede precipitar con el doble del volumen de etanol al 95%.
B. RNP también se puede eliminar lavando repetidamente el lisado celular con una solución de 0,15 MNaCL, luego extrayendo la desoxirribonucleoproteína con NaCL 1 M y luego usando el método de cloroformo-alcohol isopropílico para eliminar la proteína.
En comparación con estos dos métodos, el último método puede degradar menos ácido nucleico.
C. Al extraer ADN con una solución diluida de ácido clorhídrico, añadir detergentes adecuados, como SDS, para ayudar a separar las proteínas y el ADN. Para inhibir la degradación del ADN por la ADNasa en los tejidos, se añade citrato de sodio a la solución de cloruro de sodio como agente aglutinante para los iones metálicos. El ADN generalmente se extrae utilizando una solución de 0,15 mNACl y 0,015 m de citrato de sodio, conocida como SSC. (2) Método de detergente aniónico; las proteínas se pueden desnaturalizar con detergentes como SDS o xileno sódico, y el ADN se puede extraer directamente de materiales biológicos. Debido a que el ADN y las proteínas de las células a menudo se mantienen unidos mediante atracción electrostática o enlaces de coordinación, a menudo se utilizan detergentes aniónicos para extraer el ADN porque pueden romper este enlace de valencia.
(3) Extracción de fenol: El fenol actúa como desnaturalizante de proteínas e inhibe la degradación de la desoxirribonucleasa. Cuando el homogeneizado se trata con fenol, la superficie de las moléculas de proteína contiene muchos grupos polares similares al fenol porque los enlaces entre la proteína y el ADN se han roto. Las moléculas de proteínas se disuelven en la fase fenólica, mientras que el ADN se disuelve en la fase acuosa. Después de la centrifugación y estratificación, sacar la capa de agua y repetir la operación varias veces. Luego, se combinan las fases acuosas que contienen ADN y el ADN se precipita con etanol, aprovechando la insolubilidad de los ácidos nucleicos en etanol. En este momento, el ADN es una sustancia muy viscosa que se puede envolver en vidrio y sacar. La característica de este método es que el ADN extraído se mantiene en su estado natural.
(4) Método de extracción con agua: utilice la naturaleza soluble en agua de los ácidos nucleicos para alterar las células del tejido, luego use una solución baja en sal para eliminar el ARN y luego disuelva el precipitado en agua para disolver completamente el ADN. en agua. Recoger el sobrenadante después de la centrifugación.
Añadir cloruro de sodio sólido al sobrenadante para ajustarlo a 2,6 M, añadir dos volúmenes de etanol al 95% y agitar inmediatamente. Luego se utilizó etanol al 66%, 80% y 95% respectivamente. Se han obtenido muestras de ADN. El ADN extraído por este método tiene un alto contenido de proteínas y generalmente no se utiliza. Para eliminar proteínas, el método se puede mejorar agregando SDS durante el proceso de extracción.