La cubierta de un virus vegetal es una nucleoproteína con determinantes antigénicos en la superficie de la proteína. Cuando el virus vegetal ingresa al cuerpo del animal, puede producir anticuerpos correspondientes al antígeno que contiene el suero. es el antisuero. Los antígenos y anticuerpos correspondientes pueden producir combinaciones especializadas, es decir, los anticuerpos solo pueden unirse a sus antígenos correspondientes y producir una determinada reacción, que es una reacción sérica. Esta reacción también se puede realizar in vitro y la relación entre los dos virus se puede determinar en función de esta reacción. Por lo tanto, la detección serológica se ha convertido en una importante tecnología de identificación de virus vegetales. Las reacciones séricas comunes incluyen principalmente las siguientes:
Reacción de neutralización: combine completamente el jugo que contiene virus vegetales con los anticuerpos en el antisuero correspondiente. Cuando los anticuerpos son excesivos, todos los antígenos de los virus vegetales se pueden absorber. Como no hay partículas de virus en el jugo del virus de la planta, éste pierde su infectividad. Se trata de una reacción de neutralización que no sólo puede caracterizar virus vegetales, sino que también puede utilizarse para la determinación cuantitativa.
Reacción de precipitación: Mezclar una serie de diluciones de antígeno (virus) y una serie de diluciones de anticuerpo (antisuero). Aparecerá un precipitado dentro de un rango adecuado de la proporción de dilución. . Reacciones de este tipo, como la reacción de microprecipitación, la reacción de doble difusión en agar y la inmunoelectroforesis, son las técnicas serológicas más comunes en las pruebas de virus vegetales.
Reacción de aglutinación: El anticuerpo del virus primero es atraído hacia la superficie de una partícula que no tiene nada que ver con la inmunidad, y luego se combina con el antígeno correspondiente para provocar la aglutinación. Las partículas comúnmente utilizadas para adsorber anticuerpos incluyen bentonita, látex, polvo de carbón, células sanguíneas, proteína A, etc.
Etiquetado de anticuerpos: el anticuerpo se marca con fluoresceína, enzima o isótopo y luego se rastrea el antígeno mediante la detección del marcador. Los métodos comúnmente utilizados incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, el inmunoensayo de fluorescencia, el inmunoensayo de isótopos, etc. Este tipo de tecnología de detección es extremadamente sensible y adecuada para la detección de trazas de antígenos.
A continuación se presentan varias técnicas serológicas comúnmente utilizadas en cuarentena vegetal.
1. Reacción de microprecipitación
Cuando se añade antisuero en una proporción adecuada a una solución que contiene antígeno disuelto, el antígeno y el anticuerpo se combinan entre sí y precipitan. El método es el siguiente:
(1) Utilice un crayón para dibujar 8 líneas horizontales y verticales en el fondo de la placa de Petri para formar una cuadrícula.
(2) Tome dos filas de tubos de ensayo pequeños, de 7 a 8 en cada fila, una fila para el antígeno y una fila para el antisuero. Agregue 0,2 ml de tampón a cada tubo de ensayo.
(3) Prepare 1 mg/ml de solución madre de virus purificado, agregue 0,2 ml de la solución madre a la fila de dilución de antígeno en el primer tubo de ensayo, use una pipeta de 1 ml para aspirar 0,2 ml y transfiérala. al segundo tubo y luego transfiera 0,2 ml al tercer tubo y muévalo hasta el último tubo. La dilución de cada tubo es de 1/2 a 1/128 de la solución original.
(4) Agregue 1,5 ml de solución tampón que contenga 0,025 % de conservante NaN3 a un tubo de ensayo pequeño, mezcle 0,1 ml de antisuero sin diluir en la solución tampón y prepare un antisuero de dilución 1/16 como solución madre. 0,2 ml de la solución madre al primer tubo de ensayo de la segunda fila, mezclar y transferir 0,2 ml al segundo tubo, y así sucesivamente hasta el último tubo para preparar una serie de diluciones de antisuero de 1/32 a 1/2048.
(5) Utilice una micropipeta para partir de la dilución más alta de antisuero (1/2048), agregue 1 gota a cada cuadrado de la séptima fila horizontal de la placa de Petri, y agregue también 1/ Agregue antisuero a una dilución de 1024 a la sexta fila horizontal, de modo que todos los cuadrados de la placa goteen antisuero en varias diluciones.
(6) Utilice otra pipeta para comenzar con la solución de antígeno diluida, agregue 1 gota en cada cuadrado de la séptima columna y siga el mismo método en cada cuadrado de la primera a la séptima columnas de varios Antígenos. Las diluciones se añaden gota a gota en los cuadrados. Coloque una gota de solución tampón en los octavos cuadrados horizontales y verticales como control. Luego, las gotitas de reacción se cubren con una capa de aceite de parafina líquida para evitar la evaporación.
(7) Después de incubar la placa de Petri preparada en un ambiente húmedo a temperatura ambiente durante 2 horas, obsérvela con un microscopio de disección binocular en una habitación oscura, luego colóquela en un refrigerador común durante la noche y continúe para observar los resultados al día siguiente. En este momento la precipitación es claramente visible.
El precipitado más concentrado se considera cuatro, y los siguientes gradientes que se debilitan gradualmente se registran como tres, dos y uno respectivamente. Tres es la dilución máxima del antígeno y la cantidad mínima de suero que produce precipitación. , como la proporción óptima de antígeno y anticuerpo.
Tabla de concentraciones de reacción óptimas de antígenos y anticuerpos determinadas mediante tecnología de microprecipitación
(8) Durante la medición real, el antisuero del óptimo. se usa dilución para reaccionar con su antígeno correspondiente y antígeno heterogéneo o se usa la dilución óptima del antígeno para reaccionar con su antisuero correspondiente y antisuero heterólogo, y se puede observar la relación serológica entre ellos. Como se muestra en la Tabla 0-4-2,
La tecnología de microprecipitación determina la relación serológica entre múltiples antígenos
La dilución de cada antígeno de prueba es de 1,56 mg/ml y los resultados de la reacción de Los antisueros en diferentes diluciones de 1/4 a 1/1024 muestran que los antígenos en las filas horizontales primera, segunda, quinta, sexta y séptima son los mismos que los antígenos correspondientes de los antisueros, y los antígenos en las filas tercera y cuarta son los mismos que los de los antisueros, aunque los antígenos correspondientes de los antisueros son diferentes, tienen una cierta relación genética. Las filas octava y décima de anticuerpos generalmente están relacionadas lejanamente o no tienen ninguna relación serológica con los antígenos correspondientes de los antisueros. la novena fila de anticuerpos no tiene ninguna relación.
2. Prueba de doble difusión en agar
El contenido de agua del gel de agar es extremadamente alto, lo que permite el paso libre de sustancias macromoleculares con una masa molecular inferior a 200.000 u, y de la mayoría de antígenos y anticuerpos Los pesos moleculares están por debajo de 200.000 u. Sufren muy poca resistencia al movimiento en gel de agar y pueden difundirse libremente. La inmunodifusión aplica este principio perforando varios agujeros pequeños en una placa de gel de agar y colocándolos por separado. su anticuerpo correspondiente se introduce en el gel, y el antígeno y el anticuerpo se difunden en el gel respectivamente, formando un gradiente de concentración. En la relación óptima de concentración del antígeno y del anticuerpo, se forma una banda de precipitación de conjugados antígeno-anticuerpo visible al desnudo. Se forma el ojo. El tamaño, la forma, el número y la densidad de la banda están determinados por las características del antígeno y el anticuerpo que se están analizando. Este método es adecuado para detectar jugos crudos de plantas, líquidos clarificados y antígenos altamente purificados. Durante la prueba se utilizan jugos de plantas saludables y antígenos estándar como controles positivos y negativos. La característica de este método es que puede detectar simultáneamente la relación serológica entre un antígeno y múltiples anticuerpos, o un anticuerpo y múltiples antígenos, lo cual es extremadamente conveniente para la identificación de virus. Las desventajas son la baja sensibilidad, la gran cantidad de antisuero y el largo tiempo de detección. La tecnología de detección específica es la siguiente:
(1) Pesar el agar y agregarlo a un tampón apropiado, calentarlo en un baño de agua o microondas hasta que el agar se disuelva y agregar azida sódica al 0,1%. Coloque una placa de Petri o una placa de vidrio sobre una superficie horizontal. Cuando el agar se enfríe a 60 °C, vierta una cantidad adecuada en la placa con un espesor de 2 mm (9 ml para una placa de 50 mm x 9 mm y 26 ml para una placa de 100 mm x 13 mm). . Dejar reposar hasta que cuaje.
(2) Coloque el diagrama del patrón debajo del tablero, haga agujeros con una perforadora y retire el agar de los agujeros. Hay muchas formas de organizar los agujeros. La disposición comúnmente utilizada consiste en una central. agujero y seis agujeros circundantes Consta de agujeros, el diámetro del agujero es de 7 mm y la distancia entre los agujeros circundantes y el agujero central es de 3 ~ 4 mm.
(3) Diluir el antígeno en un tubo de ensayo pequeño con tampón o solución salina fisiológica, añadir la dilución óptima del antígeno a los pocillos circundantes y añadir la dilución óptima del antisuero al pocillo central. La concentración óptima es la combinación de una serie de diluciones de antígeno en proporción doble en los pocillos periféricos y una serie de diluciones de antisuero en proporción doble en el pocillo central para producir una línea de precipitación densa y estrecha.
(4) Incubar la placa de Petri en un ambiente humectante y observar la aparición de líneas de precipitación sobre un fondo oscuro al día siguiente. En el papel impreso con los grupos de patrones dispuestos, se marca el patrón de las líneas de precipitación y los gráficos de las líneas de precipitación se pueden conservar mediante fotografía o teñido.
(5) Juicio de resultados: Analizar antígenos y anticuerpos y la relación entre antígenos en función de la forma de la línea de precipitación.
Al realizar la detección por doble difusión en agar de virus de forma larga, se puede agregar dodecilsulfato de sodio (SDS) al medio de gel de agar. Este agente es un tensioactivo catiónico que puede eliminar los virus en fragmentos difusibles. la actividad antigénica facilita la detección.
3. Inmunoelectroforesis a contracorriente
En el caso del gel de agar como medio, la inmunoglobulina tiene una carga negativa débil que no puede compensar el efecto de la electroósmosis, por lo que se mueve hacia el electrodo negativo durante la electroforesis. Migración, mientras que las proteínas antigénicas generales tienen una fuerte carga negativa y aún migrarán al electrodo positivo después de contrarrestar la electroósmosis. La inmunoelectroforesis por convección diseñada en base a esto es un método que combina electroforesis en agar e inmunoprecipitación. El virus del antígeno se coloca en el lado del gel de agar cerca del cátodo y el anticuerpo se coloca en el lado cercano al ánodo en el DC eléctrico. campo, el antígeno se mueve hacia el electrodo positivo. Las inmunoglobulinas migran al electrodo negativo y forman una línea de inmunoprecipitación después de encontrarse. Las técnicas específicas son las siguientes:
(1) Preparación del lecho de gel.
Tome una cierta cantidad de agar en polvo y sumérjalo en agua destilada durante 2 a 3 días. Cambie el agua 1 a 2 veces al día. Prepare una solución de agar al 1% al 1,2% con tampón de ácido bórico y agregue azida sódica al 0,1%. Coloque el vaso sobre una plataforma horizontal y use una pipeta para verter agar tampón sobre la superficie de la placa para hacer un lecho de gel de 2 mm de espesor y hacer agujeros.
(2) Coloque el lecho de gel preparado en el tanque de electroforesis, agregue tampón (diluido 1 vez con el tampón preparado para gel de agar) de 2 a 4 cm de distancia de la superficie del lecho y colóquelo en el cátodo de la placa de agar agregue antígeno a un extremo del pocillo, agregue antisuero específico al otro extremo del ánodo y use dos capas de gasa en ambos extremos del lecho de agar para conectar la placa de agar al tampón en el tanque de electroforesis. electroforesis.
(3) Al realizar la electroforesis, el voltaje, la corriente y el tiempo varían según la fuerza iónica del tampón, el tamaño del lecho de electroforesis y la naturaleza del antígeno. Mientras el antígeno viral no se desnaturalice, intente mantener el voltaje lo más alto posible. Si la corriente excede los 2 mA, la electroforesis debe realizarse a baja temperatura.
(4) Después de la electroforesis, coloque la placa de electroforesis sobre un fondo negro para su observación. También puede sumergir la placa de gel de agar después de la electroforesis en solución salina fisiológica durante 30 minutos y luego colocarla en una solución de ácido pícrico durante. 20 minutos, puede teñir el fondo de amarillo y precipitarlo en blanco para una fácil observación.
La inmunoelectroforesis tiene tres ventajas sobre la doble difusión en agar. Es rápida, sensible y puede usarse para virus largos que se difunden lentamente en agar.
4. Prueba de aglutinación de látex y prueba de aglutinación de proteína A en látex.
Utilice inmunoglobulina purificada con un antisuero específico y adsorbala en partículas de látex para preparar inmunoglobulina de anticuerpos de látex sensible. Cuando se encuentra con el antígeno correspondiente, puede producirse una reacción de aglutinación. Esta es una tecnología serológica con alta sensibilidad y fuerte especificidad, pero se requiere un antisuero específico para extraer la gammaglobulina de anticuerpos cada vez, y los procedimientos de preparación son complicados e inconvenientes de aplicar. Por ejemplo, el uso directo de antisuero para sensibilizar el látex afectará significativamente el efecto. efecto. Posteriormente, Querfurth (1979) descubrió que la proteína A puede adsorber inmunoglobulinas sin afectar la unión al antígeno correspondiente. De esta manera, la proteína A se puede combinar primero con partículas de látex y luego con la inmunoglobulina del antisuero para formar un complejo de proteína A-látex-inmunoglobulina. Esta prueba de aglutinación en látex simplifica el proceso de sensibilización de las inmunoglobulinas y consigue los mismos resultados. Los métodos específicos son los siguientes.
(1) Preparación de látex sensibilizado con inmunoglobulinas.
Utilice el método de precipitación con sulfato saturado al 33 % para extraer la globulina del antisuero específico, suspenderla en tampón Tris-HCl (que contiene 0,02 % de PVP) a 0,05 mol/l, pH 7,2 y tomar 10 % de El látex blanco se diluyó 15 veces y se mezcló con una cantidad igual de solución de globulina de concentración apropiada, se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se trasladó al refrigerador durante la noche. Después de la centrifugación a baja velocidad (7000 r/min, 20 min), el precipitado se suspende en el tampón. Después de repetidas centrifugaciones y lavados dos veces, el precipitado final se suspende en el tampón para obtener el látex sensibilizado con globulina de anticuerpo.
(2) Preparación de anticuerpos sensibilizados contra látex de proteína A.
Disolver la proteína A disponible comercialmente en tampón de glicina 0,1 mol/L, pH 8,2 para preparar una solución de proteína A, mezclarla con una cantidad igual de látex blanco diluido 15 veces y dejarla a temperatura ambiente durante 3 horas Transfiera al refrigerador durante la noche. Después de la centrifugación a baja velocidad (7000 r/min durante 20 min), suspender el precipitado en tampón de glicina. Repetir la centrifugación y lavar dos veces. El precipitado se suspende en tampón de glicina para preparar una solución de látex de proteína A. Mezclarlo con una cantidad igual de antisuero. dilución adecuada y dejar a temperatura ambiente durante 3 horas. Transferir al refrigerador durante la noche. Repita la centrifugación y el lavado dos veces y finalmente suspenda el precipitado en una cantidad igual de tampón de glicina y antisuero para obtener anticuerpos sensibilizantes al látex de proteína A.
(3) Método de detección.
Utilice tampón Tris-HCl 0,05 mol/L, pH 7,2 (que contiene 0,02 % PVP, 0,02 % NaN3) para diluir el antígeno en proporciones iguales para obtener 20, 40, 80, 160, 320, 640. , 1280, una serie de concentraciones, en una placa de vidrio limpia, dibuje un cuadrado con un bolígrafo, agregue 2 gotas de antígeno de diferentes diluciones a cada cuadrado y luego agregue 1 gota de anticuerpo sensibilizante al látex (o proteína A sensibilizante al látex). anticuerpo) Después de mezclar con un microoscilador de sangre a 120 r/min, observe los resultados a simple vista o con un microscopio de disección de 10-25x. Al mismo tiempo, se utilizaron como controles líquido de látex blanco y jugo saludable.
La reacción positiva muestra aglomerados floculentos o granulares evidentes con un fondo claro y translúcido, mientras que la reacción negativa muestra un líquido lechoso uniforme. También se puede utilizar un medidor de turbidez para detectar la aglutinación.
Este método se ve menos afectado por las proteínas vegetales sanas y es adecuado para recolectar líquido clarificado directamente de plantas enfermas. No solo es adecuado para virus esféricos, sino también para virus baciliformes, rabdovirus y filovirus, y tiene. Mayor sensibilidad. Sin embargo, no es adecuado para antisueros con títulos bajos o plantas que contengan coloides en emulsión.
5. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas es un método que combina la adsorción en fase sólida y la tecnología inmunoenzimática. El antígeno o anticuerpo se recubre sobre la fase sólida. Sobre el soporte, la reacción inmune se lleva a cabo sobre la superficie sólida y el antígeno correspondiente se detecta con la ayuda del color producido por la enzima y el sustrato marcados en el anticuerpo. Este método es altamente sensible, específico, rápido, simple y extremadamente adecuado para aplicaciones de cuarentena vegetal. Los métodos de detección comúnmente utilizados incluyen los siguientes:
(1) Método directo.
Agregue la muestra de antígeno (virus) a analizar en la placa multipocillo de polietileno, incúbela y luego lávela para que el antígeno adherido a la pared reaccione con el anticuerpo γ globulina marcado con enzima agregado. , y permanece unido al antígeno después del lavado. Gammaglobulina marcada con enzima, agregue el sustrato enzimático y detecte con un espectrofotómetro.
(2) Método indirecto.
Primero utilice anticuerpo y enzima de cabra anti-globulina de conejo para preparar anticuerpos marcados con enzima. Recubra el antígeno que se va a detectar en un portador de fase sólida. Después de la incubación y el lavado, agregue antisuero de conejo específico. Lave, agregue el anticuerpo marcado con enzima anti-conejo de cabra, agregue el sustrato después de la incubación y el lavado y observe los resultados.
(3) Método sándwich de doble anticuerpo.
Primero cubra la inmunoglobulina del anticuerpo específico sobre el soporte de fase sólida. Después de la incubación y el lavado, agregue el antígeno que se va a probar para que reaccione con el anticuerpo adsorbido en el soporte. Después de la incubación y el lavado, agregue la etiqueta enzimática. la sustancia del anticuerpo específico y finalmente agregue el sustrato para observar los resultados de la reacción.
(4)Un método de enlace de proteasa.
Diluir la Proteína A con tampón de glicina pH 9,6 y recubrir la microplaca. Añadir antisuero específico para unirse a la Proteína A fijada en la microplaca, y luego añadir el antígeno a analizar. luego agregue el anticuerpo específico para reaccionar con el antígeno, agregue una enzima para marcar la proteína A y finalmente agregue el sustrato de la enzima para medir su valor de densidad óptica.
(5) Método sándwich de doble anticuerpo de animales xenogénicos.
Primero cubra la placa de microrreacción con el anticuerpo primario (anticuerpo de suero de conejo), agregue el antígeno a analizar, luego agregue el anticuerpo secundario (anticuerpo de ascitis de ratón) en una concentración adecuada y luego agregue oveja disponible comercialmente. Marcador de enzima anti-ratón y finalmente agregue sustrato para observar la reacción. Los resultados generalmente se pueden obtener en 8 horas. Este método mantiene las características del método sándwich de doble anticuerpo, que es rápido, preciso y altamente sensible, y puede aplicarse a virus esféricos, baculovirus, virus filamentosos y rabdovirus. Los anticuerpos no necesitan ser purificados y pueden usarse directamente (pero los antisueros no purificados deben seleccionar primero su concentración de trabajo óptima. El uso de marcadores enzimáticos disponibles comercialmente puede ahorrar los complejos procedimientos de preparación de anticuerpos marcados con enzimas y también puede superar reacciones no específicas). Interferencia por métodos indirectos. Gran debilidad.
(6) Método ligado a enzimas biotina-anti-biotina.
La biotina tiene una fuerte afinidad, que es 10.000 veces mayor que la de la reacción antígeno-anticuerpo. Una vez que los dos se combinan, es difícil de disociar y no se ve afectada por los desnaturalizantes ácido-base que disuelven las proteínas. enzimas y disolventes orgánicos Tiene un alto grado de estabilidad, una vez que la biotina se activa, puede acoplarse con proteínas, es decir, una macromolécula puede unirse a múltiples moléculas de biotina y la biotina puede unirse a una gran cantidad de etiquetas enzimáticas. hacer que las etiquetas enzimáticas sean multivalentes y antibióticas. La biotina en sí es una molécula multivalente y cada subunidad se puede combinar con una molécula de biotina. Por lo tanto, este método puede producir una amplificación multinivel, aumentar la sensibilidad en más de 10 veces y reducirla. reacciones no específicas, lo que hace que el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sea más eficiente. La tecnología ha dado un paso más. El método específico es el siguiente:
Primero recubra el primer anticuerpo específico (anticuerpo de conejo o anticuerpo de ascitis de ratón) en un portador de fase sólida, agregue el antígeno que se va a analizar y agregue el segundo anticuerpo específico (anticuerpo de ascitis de ratón). anticuerpo o anticuerpo de conejo), luego agregue la inmunoglobulina biotinilada correspondiente (anti-ratón de cabra o anti-conejo de cabra), agregue el conjugado de avididasa y finalmente agregue el sustrato para observar el valor de D.O.
(7) Ensayo ligado a enzimas dot sobre membrana.
Primero use un lápiz suave para dibujar una cuadrícula cuadrada de 1 cm en un trozo de membrana de nitrocelulosa del tamaño apropiado, sumerja la membrana de celulosa en tampón TBS y enjuáguela durante 30 minutos, luego coloque la membrana en dos entre el filtro. papeles, secar al aire a temperatura ambiente Utilice una pipeta para dejar caer la solución de extracción de antígeno en el centro de cada rejilla, secar al aire a temperatura ambiente, lavar la membrana con tampón TBS-T (solución TBS que contiene Tween al 0,5%) durante 5. minutos, y sáquelo sobre el papel de filtro hasta que desaparezcan las gotas de agua en la superficie de la membrana, luego sumérjalo en la solución de bloqueo (solución TBS-T que contiene 1% de albúmina sérica bovina y 2% de polivinilpirrolidona), incúbelo a 37°C durante 1 hora, sacarlo para que se seque y sumergirlo en La solución de anticuerpo primario diluida en solución de bloqueo se incubó a 37°C durante 1 hora y la membrana se lavó 10 veces con solución de TBS-T y la solución se cambió cada 5 minutos. Sumergir la membrana en globulina ligada a enzimas con una dilución de 1/200 e incubarla a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la membrana con el método anterior, enjuágala dos veces con tampón de fosfatasa alcalina durante 10 minutos cada vez. en la solución de sustrato enzimático Proteja de la luz a temperatura ambiente durante 5 a 15 minutos. Una vez completado el desarrollo del color, deseche la solución de sustrato y lave la membrana con solución de parada (10 mmol/LTris-HCl, pH 7,5, 5 mmol/LEDTA). ) durante 30 minutos, coloque la membrana en papel de filtro y séquela completamente al aire antes de observar los resultados.
Este método puede superar las deficiencias de las placas de plástico y los resultados se pueden caracterizar únicamente mediante inspección visual. No requiere instrumentos complejos, requiere muy poca cantidad de antígeno y anticuerpo y es más de 10 veces mayor. más sensible que los métodos convencionales ligados a enzimas, adecuados para la detección de una gran cantidad de antígenos.
6. Microscopía inmunoelectrónica
La microscopía electrónica puede determinar rápidamente la forma de las partículas de virus y es una tecnología indispensable para identificar virus. Sin embargo, la concentración de algunas muestras es muy baja, lo que la hace. Es difícil utilizar la microscopía electrónica ordinaria. Si las partículas del virus están recubiertas, los anticuerpos pueden capturar las partículas del virus en agregados para facilitar la observación. Al mismo tiempo, la relación serológica entre las partículas virales y los anticuerpos también se puede observar a partir de la combinación de ambos. Los siguientes métodos se utilizan habitualmente:
(1) Tecnología de suero de inmersión de hojas.
Coloque una gota de antisuero diluido sobre la malla de cobre recubierta, sumerja el corte fresco de la hoja en la gota de suero durante 1 a 2 segundos y déjelo a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos para permitir que el suero para agregar con el virus correspondiente y decorarlo, para luego realizar microscopía de tinción negativa.
(2) El método de Derrick.
Colocar la malla de cobre recubierta de colodión en antisuero diluido en tampón Tris en una proporción de 1:10 a 24°C, y luego enjuagar la malla de cobre con tampón antes de su uso. Diluir el extracto crudo de virus en tampón Tris que contenga HCl, hacer flotar la malla de cobre recubierta de suero en 0,1 ml de diluyente de virus durante 1 hora (24 °C), enjuagar primero con una solución de Tris-HCl y luego con agua. Luego secar el recubrimiento por pulverización. .
(3) Método de agregación.
Diluir el antisuero a una concentración de 1/100 con tampón fosfato, dejar caer 10μl en un portaobjetos de vidrio, triturar las hojas enfermas cortadas en cuadrados de 2 mm en las gotas de suero e hidratar en una habitación húmeda durante 15 minutos. Minutos, use pinzas para sujetar la malla de cobre de la membrana y sumérjala en la gota, enjuáguela con tampón fosfato 20 veces, luego enjuáguela con agua destilada y finalmente tiñe con 5 gotas de acetato de uranilo para observación.
(4) Método de modificación.
Tome una hoja enferma de 2 mm cuadrados y tritúrela en 10 μl de agua destilada en un portaobjetos de vidrio. Sumerja las gotas en la malla de cobre filmada para adsorber las partículas del virus en la malla de cobre y luego use 20 gotas de. agua sobre la malla de cobre Enjuague con tampón fosfato, absorba el agua, agregue 1 gota de antisuero diluido al 1/100, humedezca en un cuarto húmedo durante 15 minutos, enjuague la malla de cobre con 20 gotas de tampón fosfato y 30 gotas de destilado. agua y finalmente teñir con acetato de uranilo.
(5) Método de modificación del atrapamiento.
Primero recubrir la malla de cobre con antisuero específico diluido 1/10 o 1/100, luego dejar caer la muestra de virus sobre la malla de cobre, hidratarla durante 15 minutos, enjuagar con tampón y agua destilada y secar. y luego agregue 1 gota de antisuero específico diluido a 1/100, incube durante 15 minutos, enjuague con tampón y agua destilada y seque el microscopio teñido.
(6) Método de modificación de la captura del suero anti-conejo de oveja.
Antes de teñir el método de modificación de la trampa, añadir 1 gota de suero de cabra anticonejo diluido 1/20, incubar durante 15 minutos, lavar y teñir al microscopio. En este método, la capa de partículas del virus se recubre con dos capas de suero, lo que obviamente es llamativo. Las partículas del virus se pueden ver claramente bajo un microscopio electrónico de bajo aumento de 2000 veces.
(7) Proteína Un método de modificación de captura.
Poner 1 gota de solución de proteína A de 50 mg/ml sobre la malla de cobre de la membrana Forma. Después de la incubación, lavar el exceso de proteína A, luego cubrir con antisuero específico diluido 100 veces y agregar el antígeno. gota a gota, luego dejar caer el antisuero específico y finalmente teñir y examinar al microscopio. Este método es más sensible que el método general de modificación por captura y puede capturar más partículas de virus.