Con el objetivo de abordar el fenómeno común del pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales, se analizan en detalle el mecanismo y los factores que influyen, y se proponen las contramedidas correspondientes, proporcionando investigación y producción científicas Ciertos teóricos y base práctica.
Palabras clave: cultivo de tejidos vegetales, pardeamiento, contramedidas
Actualmente, muchos cultivos de tejidos vegetales se encuentran con frecuencia con fenómenos de pardeamiento. Master Browning
Ocurre frecuentemente en explantes, subcultivos de callos de plantas, cultivos de células en suspensión y cultivos de aislamiento de protoplastos. Los productos de oscurecimiento no sólo oscurecen los explantes, las células y los medios de cultivo, sino que también inhiben muchas enzimas, afectando así el crecimiento y la diferenciación de los cultivos e incluso provocando la muerte en casos graves. Este artículo analiza los factores que influyen, los mecanismos y las medidas preventivas del oscurecimiento en el cultivo de tejidos vegetales, que tiene una importancia práctica importante para nuestra investigación científica o producción industrial, incluido el cultivo de tejidos vegetales, el cultivo de protoplastos, el cultivo de células en suspensión y el cultivo de órganos vegetales.
1 Factores que afectan el pardeamiento
Los factores que afectan el pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales son complejos. Debido a las diferentes especies de plantas, genotipos, explantes y condiciones fisiológicas, el grado de pardeamiento también es diferente. .
1.1 Diferentes plantas y genotipos determinan diferentes grados de pardeamiento. En el cultivo de tejidos, la dificultad de oscurecer entre cultivares puede estar relacionada con diferencias en el contenido de polifenoles y la actividad de la polifenol oxidasa (PPO).
1.2 Ubicación y estado fisiológico de los explantes El grado de pardeamiento de los explantes varía dependiendo de su ubicación y estado fisiológico. Al mismo tiempo, el grado de pardeamiento de los explantes en diferentes etapas y edades también es diferente.
1.3 Componentes del medio Las sales inorgánicas, la concentración de sacarosa y los niveles hormonales en los componentes del medio tienen un impacto especialmente importante en el grado de pardeamiento. Además, su valor de pH también tiene una gran relación con el grado de dorado.
1.4 Las condiciones de cultivo, una temperatura demasiado alta o una luz demasiado intensa acelerarán el oscurecimiento de los tejidos cultivados. Las condiciones ambientales adversas pueden provocar la muerte celular programada, y la temperatura es el principal factor que induce la muerte celular programada [1].
2 Mecanismo de pardeamiento
2.1 Pardeamiento no enzimático
El pardeamiento no enzimático se refiere a la muerte celular programada o muerte natural causada por estrés u otras condiciones adversas, es decir. El pardeamiento causado por necrosis no implica la producción de fenólicos. Xu Zhenbiao et al. [1] transfirieron tejido de callo en crecimiento normal a un medio que contenía NaCl. Se produjo un oscurecimiento alrededor del tejido, especialmente en la parte en contacto con el medio, pero no se observó material de oscurecimiento difuso en el medio. Este fenómeno también se produce cuando la temperatura aumenta y el subcultivo se almacena durante demasiado tiempo. Sin embargo, si se toman las medidas adecuadas o el callo se adapta al entorno de estrés, este oscurecimiento no volverá a ocurrir [3].
2.2 Pardeamiento enzimático
Actualmente, se cree que el pardeamiento en cultivos de tejidos vegetales es causado principalmente por pardeamiento enzimático, y el pardeamiento en cultivos es causado principalmente por compuestos fenólicos secretados por las heridas [. 4]. El pardeamiento enzimático, al igual que las reacciones enzimáticas generales, debe cumplir tres condiciones: enzima, sustrato y oxígeno. Las enzimas que causan el pardeamiento incluyen polifenol oxidasa, peroxidasa, fenilalanina amoníaco liasa, etc. A juzgar por el grado de pardeamiento y la actividad de la PPO de las plántulas de probeta durante el cultivo primario y el subcultivo, la actividad de la PPO es la clave para el pardeamiento del cultivo. Los sustratos de las enzimas que provocan el pardeamiento son principalmente compuestos fenólicos, que se pueden dividir en tres categorías según su composición: ácidos bencenocarboxílicos (incluidos el o-hidroxifenol, catecol, ácido gálico, ácido shikímico, etc.), derivados de fenilpropanoides (incluidos los clorogénicos). ácido, ácido cinámico, ácido cumárico, ácido cafeico, taninos, lignina, etc.) y derivados de flavanos (incluidas antocianinas, flavonoides, rutina, etc.), pero no todos los fenoles son cuasi-sustancias.
En los tejidos vegetales normales, los sustratos, el oxígeno y la PPO conviven sin oscurecerse, porque en las células del tejido normal, los polifenoles se distribuyen en las vacuolas de las células, mientras que la PPO se distribuye en varios plastidios o en el citoplasma, este regional La distribución evita el contacto del sustrato con el PPO. Pero cuando la estructura de la membrana celular cambia y se destruye, se crean las condiciones para que la enzima entre en contacto con la PPO. En presencia de oxígeno, las sustancias fenólicas se oxidan en quinonas, sufren una serie de reacciones de deshidratación y polimerización y finalmente forman sustancias de color marrón oscuro, provocando el oscurecimiento.
3 Contramedidas para prevenir el pardeamiento del explante
Teóricamente, el pardeamiento enzimático se puede inhibir mediante los siguientes tres métodos: primero, eliminar la sustancia que causa la oxidación: el oxígeno; el segundo es capturar o; reducir los intermedios de polimerización; el tercero es inhibir las enzimas relacionadas. En la práctica, las siguientes medidas se consideran efectivas.
3.1 Selección de explantes adecuados
A la hora de recolectar materiales, prestar atención a seleccionar variedades y partes con menos pardeamiento como explantes. El grado de oscurecimiento de las plantas adultas es más grave que el de las plántulas, y el grado de oscurecimiento de los materiales de verano es más grave que el de los materiales de invierno, principios de primavera y otoño. Los cogollos no son fáciles de cultivar en invierno, por lo que se deben seleccionar materiales de principios de primavera y otoño como explantes. Wang Yixing[5] utilizó plántulas estériles de lichi para inducir diferentes tejidos. Los resultados mostraron que los segmentos del tallo fueron los más fáciles de inducir callos. Después de 2 semanas de cultivo, crecieron callos de color amarillo claro. La mayoría de las hojas no produjeron callos o indujeron un oscurecimiento moderado; sin embargo, la mayoría de las raíces no produjeron callos y todos los callos inducidos se volvieron marrones;
3.2 Tratamiento de explantes
El pretratamiento de explantes propensos a oscurecerse puede reducir los efectos tóxicos de los compuestos de quinona. El método de tratamiento es el siguiente: después de lavar los explantes con agua corriente, se tratan a una temperatura baja de 2 a 5 °C durante 12 a 24 horas, luego se desinfectan con cloruro de mercurio o alcohol 70 y luego se inoculan en agar. medio que contiene sólo sacarosa durante 5-7 días, permitiendo que las sustancias fenólicas del tejido penetren parcialmente en el medio de cultivo. Retire los explantes, sumérjalos en una solución de lejía 0,1 durante 10 minutos y luego inocúlelos en un medio de cultivo adecuado. Si aún se escapan fenoles, transfiera el medio de cultivo 2-3 veces después de 3-5 días. Cuando la incisión del explante cicatriza, las sustancias fenólicas se reducen, lo que puede reducir o inhibir por completo el oscurecimiento del explante. He Qiongying et al. [6] utilizaron ácido ascórbico para pretratar los explantes chupadores de yemas de plátano para reducir el oscurecimiento de los explantes, aumentando así la tasa de inducción de los racimos de yemas.
3.3 Medio de cultivo adecuado
La composición del medio de cultivo está relacionada con el grado de pardeamiento, y se debe considerar la forma del medio de cultivo seleccionado.
Estado y tipo.
3.3.1 Concentración adecuada de sales inorgánicas Zhang Miaoxia et al. [7] En la prueba anti-pardeamiento del cultivo de tejido de caqui, las sales inorgánicas de los cuatro medios de cultivo se incrementaron a la mitad de la cantidad de elementos principales ( MS) y 1/2MS, el efecto de la MS es pobre. Los resultados demuestran que bajas concentraciones de sales inorgánicas pueden promover el crecimiento y la diferenciación de los explantes y reducir el grado de oscurecimiento de los explantes. La investigación de Xu Zhenbiao [1] muestra que a medida que aumenta la concentración de NaCl, el oscurecimiento se vuelve más grave.
3.3.2 Hormonas apropiadas y apropiadas Wang Yixing [5] Durante el proceso de cultivo de tejido de lichi, cuando se agregaron 1 mg/LBA 0,5 mg/L2 y 4-D al medio de cultivo, el callo estaba duro y de proliferación lenta, fácil de dorarse. Cuando se agrega 1 mg/LBA 1 mg/L2, 4-D al medio de cultivo, el tejido del callo será de color amarillo claro y suelto, y proliferará rápidamente.
3.3.3 La dureza del medio de cultivo está dentro de un cierto rango. Si la cantidad de agar es grande, la dureza del medio de cultivo será alta y la tasa de pardeamiento será baja [8]. Esto puede deberse a que la dureza del medio de cultivo afecta la velocidad de difusión de las sustancias fenólicas.
3.3.4 Efecto de la dureza del agua en el medio de cultivo: El agua destilada con baja dureza tiene una baja tasa de pardeamiento, mientras que el agua del grifo con alta dureza tiene un pardeamiento severo e incluso un pardeamiento mortal [8]. Esto puede deberse a que el agua utilizada para preparar el medio cambia la concentración de sales inorgánicas en el medio, lo que afecta indirectamente el pardeamiento de los explantes de plantas.
3.3.5 Valor de pH del medio de cultivo En el cultivo de células somáticas de arroz, el medio de cultivo líquido MS puede mantener un buen estado de crecimiento del callo a un valor de pH de 4,5 a 5,0 y su superficie será de color blanco amarillento. , y cuando el valor del pH es 5,5-6,0, el callo se vuelve muy dorado [9]. En términos generales, un ambiente ácido (pH 4,5-5,0) no favorece el proceso de oscurecimiento [10].
3.3.6 Si las condiciones de cultivo son demasiado altas o la luz es demasiado fuerte, la luz aumentará la actividad de la PPO y promoverá la oxidación de los polifenoles, acelerando así el oscurecimiento del tejido cultivado. Las altas concentraciones de CO2 también pueden favorecer el oscurecimiento. La razón es que el CO2 del ambiente se difunde hacia las células, aumentando el CO32- intracelular, y el CO32- se combina con el CO32- en la membrana celular, reduciendo el CO32- efectivo, lo que lleva a la desintegración del sistema de endomembranas y al contacto entre los compuestos fenólicos. sustancias y PPO, lo que resulta en un oscurecimiento [11].
Por lo tanto, el cultivo inicial debe realizarse en la oscuridad o con poca luz.
3.4 Añadir inhibidores de pardeamiento y adsorbentes
Los inhibidores de pardeamiento incluyen principalmente antioxidantes e inhibidores de PPO. Añade antioxidantes como metabisulfito de sodio, L-cisteína, ácido ascórbico, ácido cítrico, ditiotreitol, etc. Puede reaccionar con el producto de oxidación quinona en el medio de cultivo y este último puede reducirse a fenol [12]. Dado que su proceso de acción es consuntivo, se debe prestar atención a la dosificación en aplicaciones prácticas. La L-cisteína y el ácido ascórbico no tienen efectos secundarios tóxicos en los explantes y pueden usarse en producción y aplicaciones sin restricciones. Agregar ácido fítico (PA) al medio de cultivo de células de arroz puede prevenir el oscurecimiento. Muchos grupos hidroxilo en las moléculas de PA tienen efectos antioxidantes, reduciendo el contenido de sustancias que desarrollan color o la combinación de PA con Cu2 en las moléculas de PPO, reduciendo así su actividad. Chen Xuesen et al. [13] también confirmaron que el ácido fítico puede inhibir la actividad de la polifenol oxidasa al estudiar la aplicación de ácido fítico en el cultivo de tejidos de ginkgo.
Los adsorbentes más utilizados incluyen el carbón activado y la polivinilpirrolidona (PVP). El carbón activado es un adsorbente inorgánico altamente absorbente que puede adsorber sustancias nocivas en el medio de cultivo, incluidas impurezas en agar, fenoles y quinonas secretadas por el cultivo y 5-hidroximetilfurfural producido por la esterilización a alta presión de sacarosa. cultura. El carbón activado en polvo tiene propiedades de adsorción más fuertes que el carbón activado granular. Generalmente, se añaden 1-4 g/l de carbón activado al medio de cultivo. Cabe señalar que para evitar el oscurecimiento se debe utilizar la concentración más baja de carbón activado, debido a que la adsorción del carbón activado no es selectiva y también adsorberá otros componentes en el medio de cultivo, lo que tendrá un cierto impacto negativo en el Diferenciación inducida de explantes [14]. La polivinilpirrolidona (PVP) es un adsorbente específico para sustancias fenólicas. A menudo se usa como agente protector para sustancias fenólicas y orgánulos celulares en preparaciones bioquímicas y puede usarse para prevenir el oscurecimiento [15].
3.5 Realizar cribado celular y transferencias múltiples.
Durante el proceso de cultivo de tejidos, las células que son propensas a oscurecerse se pueden eliminar mediante un cribado celular frecuente. Los explantes deben transferirse inmediatamente a un medio de cultivo fresco 1-2 días después de la inoculación. Esto puede reducir el efecto tóxico de las sustancias fenólicas en el cultivo y reducir la inhibición, de modo que los explantes puedan meristemar lo más rápido posible. Transferir 5-6 veces continuamente. Básicamente puede resolver el problema del oscurecimiento de los explantes.
Materiales de referencia:
[1] Xu Zhenbiao et al. Fenómeno del pardeamiento en cultivo de tejidos vegetales. Ciencia agrícola extranjera: cultivos diversos, 1997 (1): 55 ~ 56.
[2]Fu Jin. Estudio sobre el proceso de germinación en dormancia y envejecimiento de semillas de tres tipos diferentes de semillas. Tesis de maestría de la Universidad Agrícola de Beijing, 1996.
[3]Fu Zuoshen, Detección y análisis característico de callos embriogénicos de maíz resistentes al NaCl, Tesis de maestría de la Universidad Agrícola y Animal de Changchun, 1996.
[4] Yan Changmin, Manual de cultivo de tejidos vegetales, Shanghai Science and Technology Press, 1990.
Wang Yixing. Estudio preliminar sobre cultivo de células de lichi. Revista de la Universidad de Jinan, 1997, 18 (5): 84 ~ 85.
[6] He Qiongying et al. Informe preliminar sobre el pretratamiento con ácido ascórbico para prevenir el oscurecimiento de los explantes en ciernes de plátano. Revista de la Universidad Agrícola del Sur de China, 1995, 16 (3): 79 ~ 82.
Zhang Miaoxia. Estudio sobre la prevención del oscurecimiento de explantes mediante cultivo de tejidos de caqui. Revista de la Universidad Agrícola de Henan, 1999, 33 (1): 87 ~ 91.
Jin Jianmin. Discusión sobre factores relacionados con la inducción embrioide en panículas de arroz y semillas maduras. Boletín de Botánica China, 1992, 9 (2): 53 ~ 54.
Jin Jianmin. Discusión sobre factores relacionados con la inducción embrioide en panículas de arroz y semillas maduras. Boletín de Botánica China, 1992.
[10] Wang Dongxia et al. Cómo combatir el oscurecimiento de los tejidos vegetales, Chinese Flower Bonsai, 2002, 12: 29 ~ 30.
[11]Yao Hongjun, Luo Xiaofang, Tian Yanting. Avances en la investigación sobre el pardeamiento de explantes en cultivos de tejidos vegetales. Revista de la Universidad Forestal de Beijing, 1999, 21 (3): 78 ~ 83.
[12] Cai Jinxing et al. Investigación sobre las características de la polifenol oxidasa y sus inhibidores en diferentes variedades de pera. Revista de la Universidad Normal Técnica y Agrícola de Hebei, 1999, 13 (1): 55 ~ 57.
[13] Chen Xuesen, Zhang, et al. Investigación sobre la aplicación del ácido fítico en el cultivo de tejidos de ginkgo. Investigación y desarrollo de productos naturales, 1997, 9 (2): 24 ~ 27.
Liu Yongsheng. Aplicación de carbón activado en cultivo de tejidos vegetales. Cartas de fisiología vegetal, 1994, 30(3): 214.
[15]Yao Hongjun et al. Avances en la investigación sobre el pardeamiento de explantes en cultivos de tejidos vegetales. Revista de la Universidad Forestal de Beijing, 1999, 21 (3): 78 ~ 84.
"Sobre los factores de pardeamiento y contramedidas en el cultivo de tejidos vegetales" proviene del Secretario 114. Bienvenido a leer los factores y contramedidas del oscurecimiento en el cultivo de tejidos vegetales.
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Cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales, es decir, la tecnología de cultivo estéril de plantas, se basa en la teoría de que las células vegetales son totipotentes y se utilizan en vitro Órganos, tejidos o células, como raíces, tallos, hojas, flores, frutos, semillas, embriones, óvulos, ovarios, anteras, polen, parénquima y tejidos vasculares de órganos de almacenamiento, etc. , callos y tejido adventicio pueden inducirse en medios de cultivo artificiales estériles y apropiados, luz, temperatura y otras condiciones. Hasta ahora, la tecnología del cultivo de tejidos se ha utilizado ampliamente en la reproducción asexual, el mejoramiento floral, las plantas libres de virus y la preservación de germoplasma.
(1) Aplicación de la tecnología de cultivo de tejidos
1. Propagación clonal La propagación clonal es una de las principales aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales. Las ventajas de utilizar el cultivo de tejidos vegetales para la propagación vegetativa son que utiliza menos materiales, es rápido y no se ve afectado por condiciones naturales como el clima, la estación, el sustrato, etc., y es mucho más rápido que los métodos de propagación convencionales tradicionales. La gente también lo llama "propagación rápida" o "micropropagación". Los métodos de propagación comunes incluyen esquejes de ramas cortas, multiplicación de yemas, protocormos, diferenciación de órganos y embriogénesis. Entre ellos, la propagación por injerto de yemas es la más utilizada en la propagación de flores en macetas, como manzanos herbáceos, crestas de gallo, caléndulas y bígaros, plantas de follaje, ranúnculo, begonia, pasto, coliflor, arrurruz de terciopelo y plantas leñosas, triángulo y rododendro belga, rosa. , hortensias, etc., han logrado buenos beneficios económicos en la práctica de producción. El cultivo de protocormos se ha utilizado ampliamente para la producción a gran escala de orquídeas como cymbidium, phalaenopsis, paphiopedilum, dendrobium, orquídeas y helechos ornamentales como el helecho riñón, el helecho fénix y el helecho cola de ciervo. Para el cultivo de cuerpos embrioides, se ha informado que sus callos pueden diferenciarse en cuerpos embrioides en 150 especies de plantas de 30 familias. La coliflor y la camelia en macetas son ejemplos exitosos. La diferenciación de órganos produce principalmente brotes o raíces adventicias directamente a partir de explantes. En términos generales, las plantas no se forman por diferenciación de órganos callosos porque sus rasgos pueden cambiar o perderán la capacidad de regenerar plantas después de múltiples subcultivos.
2. Mejoramiento de flores En el mejoramiento de flores en macetas actual, la tecnología de cultivo de tejidos también se usa ampliamente.
Cultivo de embriones: En la hibridación interespecífica o hibridación a distancia de flores, aunque en ocasiones la fecundación puede ser normal, el embrión suele ser incompleto o incompatible con el endospermo, por lo que no se pueden obtener semillas. El cultivo temprano de embriones in vitro se puede utilizar para promover el desarrollo normal de los embriones y cultivar descendencia híbrida. Por ejemplo, camelia, lirio, iris, etc., todos utilizan cultivo de embriones inmaduros para obtener con éxito semillas híbridas. Al mismo tiempo, en la hibridación es difícil fertilizar y los óvulos no fertilizados también se pueden fertilizar por separado del polen en tubos de ensayo, lo que ha tenido éxito en la flor herbácea del castaño de agua.
Cría haploide: induce que el polen forme haploides a través del cultivo de anteras y utiliza el tratamiento con colchicina en el cultivo en probeta para duplicar los cromosomas, acortando así el tiempo de reproducción de nuevas variedades y facilitando el aislamiento de mutaciones recesivas. Existen variaciones en el tipo de planta, color de flor, tamaño de flor o pétalos dobles, tipo de hoja, color de hoja, etc. y a menudo tienen valor de uso directo. Esto se ha utilizado en la cría de petunias.
Hibridación somática e ingeniería genética vegetal: Utilizando la tecnología de manipulación genética de protoplastos se pueden obtener híbridos somáticos o híbridos nucleares a partir de plantas de diferentes géneros que antes eran imposibles de hibridar. Algunos rasgos importantes de las plantas pueden transformarse mediante la ingestión de genes exógenos de interés.
3. Flores de plantas libres de virus como crisantemos, claveles, tulipanes, azucenas, lirios de la paz, etc. Los que se propagan mediante reproducción asexual no pueden desintoxicarse a través de semillas, y el control químico y el tratamiento a altas temperaturas suelen ser ineficaces. Como material de propagación asexual para el cultivo de tejidos, es mejor eliminar el tejido viral; de lo contrario, fácilmente se acumulará el virus y se agravará el daño. Las puntas de los tallos de las plantas no tienen haces vasculares, lo que dificulta la invasión de virus. Por lo tanto, el cultivo de puntas de brotes es la mejor manera de obtener plantas libres de virus. Hasta ahora, el método de desintoxicación del cultivo de la punta del tallo se ha utilizado ampliamente en flores en macetas como crisantemos, lirios, claveles y tulipanes.
4. Las plantas preservadas con germoplasma de propagación asexual no tienen semillas y sólo pueden cultivarse y conservarse en jardines botánicos durante mucho tiempo, lo que consume mucha tierra y mano de obra. Los materiales de germoplasma también son susceptibles a cambios en el entorno natural y a plagas y enfermedades. Si se utiliza el cultivo de tejidos para preservar callos, cuerpos embrioides, puntas de brotes y otros tejidos, se puede ahorrar mucha mano de obra y recursos materiales.
(2) Varios pasos del cultivo de tejidos
1. Selección de materiales Generalmente, los materiales utilizados para el cultivo de tejidos se denominan explantes. Generalmente dividido en dos categorías. Un tipo son los explantes con yemas, como puntas de tallo, yemas laterales, yemas de bulbo, protocormos, etc. , puede inducir directamente la producción de yemas agrupadas durante el cultivo de tejidos. La tasa de éxito de las plantas regeneradas es alta, la variabilidad es pequeña y es fácil mantener las excelentes características del material. La otra categoría incluye principalmente órganos vegetativos como raíces, tallos y hojas, y órganos reproductivos como anteras, pétalos, raquis, cáliz, óvulos y frutos. Este tipo de explante requiere un proceso de desdiferenciación, tras pasar por la etapa de callo, se diferenciará en yemas o producirá cuerpos embrioides, formando así plantas regeneradas.
El uso de explantes, la ubicación de los tejidos, la edad de la planta, la temporada de muestreo, el estado fisiológico y la calidad de la planta tienen un cierto impacto en la diferenciación de órganos durante el cultivo. Generalmente, las plántulas son más fáciles de diferenciar que las variedades más antiguas, las yemas terminales son más fáciles de diferenciar que las yemas axilares y las yemas son más fáciles de diferenciar que las yemas latentes. En el cultivo de tejidos, el explante más utilizado es la punta del tallo, que suele cortarse en pequeños trozos de aproximadamente 0,5 cm. Si es demasiado pequeño, la capacidad de producir callos será deficiente; si es demasiado grande, ocupará demasiado espacio en el frasco de cultivo. El meristemo de la punta del brote se usa comúnmente para cultivar plántulas libres de virus y su longitud es inferior a 0,1 mm.
2. Esterilización de explantes Uno de los factores importantes para el éxito del cultivo de tejidos vegetales es garantizar que el cultivo pueda crecer de forma segura en condiciones estériles. Por lo tanto, los explantes deben esterilizarse y manipularse asépticamente.
Debido a que la mayoría de los materiales vegetales cultivados se recolectan de plantas de campo, a menudo se adhieren varios microorganismos a los materiales. Una vez que se introducen en el medio de cultivo, se multiplicarán y crecerán rápidamente, provocando contaminación y fracaso del cultivo. Por lo tanto, los explantes deben desinfectarse estrictamente antes del cultivo. La escala de desinfección es matar todos los microorganismos adheridos a los explantes sin destruir la viabilidad de los materiales. Por tanto, es necesaria la correcta selección del desinfectante y su concentración, tiempo de tratamiento y procedimientos. Los desinfectantes de uso común actualmente incluyen hipoclorito de calcio, cloruro de mercurio, hipoclorito de sodio, peróxido de hidrógeno, alcohol (70), etc. Los métodos de desinfección específicos son los siguientes:
(1) Antes de desinfectar las puntas de los tallos, tallos y hojas, enjuáguelos con agua limpia o quíteles el polvo con un cepillo suave. Lave los peludos con jabón. y luego enjuague el jabón con agua limpia. Después del lavado, use papel absorbente para absorber la humedad de la superficie, sumérjalo en alcohol al 70% durante unos segundos e inmediatamente sumérjalo en un sobrenadante saturado de hipoclorito de calcio 10 después de sacarlo. O sumérjalo en una solución de hipoclorito de sodio 2~10 durante 6~15 minutos. Después de la desinfección, enjuague con agua esterilizada tres veces y utilice una gasa o papel esterilizado para absorber el inóculo.
(2) Desinfección de raíces, tubérculos y bulbos La mayoría de estos materiales crecen en el suelo, a menudo se ensucian y se dañan fácilmente al excavar. Antes de la desinfección, se debe lavar con agua limpia. En lugares irregulares y con escamas, la suciedad se debe limpiar con un cepillo o cepillo suave. Después de absorberlo con papel absorbente, remójelo en alcohol al 70 % y luego sumérjalo en una solución de hipoclorito de sodio al 6 ~ 10 % durante 5 a 15 minutos, o use cloro gaseoso al 0,1 ~ 0,2 %.
(3) Esterilización de frutos y semillas Algunos de estos materiales tienen pelos o cera en su piel. Antes de la desinfección, remoje en alcohol al 70% durante unos segundos o de 2 a 10 minutos, luego desinfecte con el sobrenadante de polvo blanqueador saturado durante 10 a 30 minutos o remoje en 2 soluciones de hipoclorito de sodio durante 10 a 20 minutos. Después de la desinfección, pele y retire. tejidos o tejidos internos.
Esterilice las semillas o frutos directamente y los materiales esterilizados deben enjuagarse con agua esterilizada varias veces antes de la inoculación.
(4) Esterilización de anteras y polen Las anteras de las plantas suelen estar envueltas por pétalos y cálices y generalmente se encuentran en estado estéril. Sólo pueden inocularse mediante desinfección de la superficie. Por lo general, primero limpie los cogollos o las vainas de las hojas con 70 bolas de algodón con alcohol, luego retire las pieles de los cogollos, sumérjalas en el sobrenadante de polvo blanqueador saturado durante 10 a 15 minutos, enjuáguelas con agua esterilizada de 2 a 3 veces, chupelas hasta secarlas y luego inocúlelas. .
3. Condiciones del cultivo de tejidos: el recipiente de cultivo después de la inoculación se coloca en la sala de cultivo. La temperatura ambiente debe controlarse entre 23 y 26 ℃, con 12 a 16 horas de luz al día e iluminación. de 1000~3000 lux.
4. Proliferación de explantes Para poder diferenciarse en yemas agrupadas, tejido calloso o cuerpos embrioides, se debe diseñar y cribar estrictamente el medio de cultivo y los tipos y concentraciones de hormonas. El medio básico comúnmente utilizado es el medio MS. El tipo y la concentración de hormonas juegan un papel importante en la diferenciación y proliferación de los explantes. En otras palabras, diferentes especies de flores tienen diferentes tipos y concentraciones de hormonas (Tabla 4-3).
5. Las yemas adventicias y las yemas laterales formadas por enraizamiento inducido y subcultivo generalmente no tienen raíces. Para promover el enraizamiento de las plántulas de tubo de ensayo, se deben transferir a un medio de enraizamiento. El medio de enraizamiento es generalmente medio ms, porque reducir la concentración de sales inorgánicas es beneficioso para la diferenciación de las raíces. Al mismo tiempo, los tipos y concentraciones de auxina necesarios para que diferentes plantas en macetas induzcan el enraizamiento también son diferentes (Tabla 4-4). Los más utilizados son el ácido indol acético (IAA), el ácido naftaleno acético (NAA) y el ácido indol butírico (IBA). Generalmente, se pueden obtener raíces fuertes después de cultivar en un medio de enraizamiento durante aproximadamente 1 mes.
6. Las plántulas de cultivo de tejidos o plántulas de probeta que forman los primordios de la raíz deben pasar por un proceso de endurecimiento de las plántulas cuando ingresan al ambiente natural desde un ambiente estéril con temperatura, luz y humedad estables. De la heterotrofia a la autotrofia debe pasar por un proceso. Primero abra el corcho del tubo de ensayo y déjelo reposar en un lugar soleado durante 1 a 2 días, luego saque las plántulas, lave el agar con agua tibia y trasplántelas a una matriz compuesta de turba, perlita, vermiculita, paja. ceniza, etc. La matriz debe esterilizarse a alta temperatura antes de su uso y protegerse adecuadamente después del trasplante. Se puede cubrir con una película plástica, la humedad del aire debe mantenerse en un nivel alto, la temperatura debe mantenerse en aproximadamente 25°C y no debe exponerse a la luz solar directa.