GB4789.3-2010 "Norma Nacional de Seguridad Alimentaria Inspección Microbiológica de Alimentos Recuento de coliformes" método nº 1: Método de recuento de NMP de coliformes. El segundo método: método de recuento de coliformes en placa. Ambos métodos son adecuados para contar coliformes en diversos alimentos.
Los coliformes son un grupo de bacilos Gram-negativos aeróbicos y anaeróbicos facultativos que pueden fermentar lactosa, producir ácido y gas bajo ciertas condiciones de cultivo. Su principal importancia de detección es reflejar el estado de higiene de los alimentos y especular sobre la posibilidad. de bacterias patógenas intestinales. Las bacterias coliformes se utilizan a menudo como indicadores de contaminación fecal para evaluar la calidad higiénica de los alimentos e inferir si existe la posibilidad de contaminación de bacterias patógenas intestinales en los alimentos.
Método 1:
Antes de ingresar al quirófano esterilizado, debe ponerse ropa de laboratorio esterilizada, gorro, mascarilla y guantes esterilizados. Después de ingresar al quirófano estéril, queme completamente las pinzas en la llama exterior de la lámpara de alcohol, tome una cantidad adecuada de algodón con alcohol y límpiese bien las manos antes de continuar con la operación experimental. El alcohol es inflamable, por lo que al limpiarse las manos, debe mantenerse a cierta distancia de la llama de la lámpara de alcohol para evitar peligros. Espere hasta que el alcohol de sus manos se evapore antes de realizar cualquier operación experimental.
Dilución de la muestra: Colocar una bolsa homogénea estéril limpia en el diluidor automático, colocar la cuchara de pesaje en el exterior de la lámpara de alcohol y quemarla por un momento, y pesar con precisión 25g de la muestra en el bolsa homogénea estéril. Utilice la llama exterior de una lámpara de alcohol para quemar el puerto de inyección de agua por un momento y luego inyecte 225 ml de solución salina fisiológica estéril o tampón de fosfato en la bolsa homogénea que contiene la muestra. Retire la bolsa de homogeneización, coloque la bolsa de homogeneización en un homogeneizador tipo bofetada y bata con el homogeneizador durante 1 a 2 minutos para obtener una solución homogénea de muestra 1:10.
Nota: El valor del pH de la solución homogénea de la muestra debe estar entre 6,5 y 7,5. Si es necesario, se puede ajustar con 1 mol/L de hidróxido de sodio estéril o 1 mol/L de solución estéril de ácido clorhídrico. Una vez completada la homogeneización, coloque la bolsa de homogeneización en el marco de muestra. Utilice un marcador para marcar la muestra y la dilución en el tubo de ensayo estéril. Utilice una pipeta estéril para extraer 1 ml de la solución homogénea de muestra 1:10 e inyéctela lentamente a lo largo de la pared del tubo en un tubo de ensayo estéril que contenga 9 ml de solución salina fisiológica. La boca del tubo de ensayo debe quemarse por un momento en una lámpara de alcohol antes y después de la dilución. Después de agregar el tapón, mezcle uniformemente en el oscilador para obtener una solución homogénea de muestra 1:100. De acuerdo con la estimación del estado de contaminación de la muestra, siga las operaciones anteriores para preparar una serie de diez veces de soluciones homogéneas de muestra diluidas. Al diluir la muestra, tenga cuidado de no tocar la superficie del diluyente con la punta de la pipeta o punta. Para cada dilución incremental, utilice una pipeta o punta estéril de 1 ml.
Prueba de fermentación inicial: Seleccionar 3 diluciones seriadas apropiadas de solución homogénea de muestra para cada muestra, inocular 3 tubos de caldo lauril sulfato triptona (LST) para cada dilución e inocular 1 mL en cada tubo. Tenga en cuenta que cuando el volumen de inoculación supera 1 ml, se utiliza caldo LST de doble material. El caldo LST de doble material se refiere a un medio de cultivo con el doble de ingredientes, excepto agua destilada, durante la preparación.
En esta prueba, se agregaron 10 ml de dilución de muestra diez veces a los primeros tres tubos de ensayo estériles, y el medio de cultivo fue caldo LST doble al cuarto; al sexto tubo, y el medio de cultivo era caldo de un solo ingrediente; agregue una dilución 100 veces a los tubos 7 a 9 para inocular 1 ml, y el medio de cultivo es caldo de un solo ingrediente; la boca del tubo de ensayo debe quemarse con; una lámpara de alcohol por un momento antes y después de la inoculación, y agite uniformemente a tiempo después de la inoculación. Todo el proceso desde la preparación de la solución homogénea de la muestra hasta la finalización de la inoculación de la muestra no deberá exceder los 15 minutos.
Después de la inoculación, coloque el tubo de caldo LST en la incubadora durante 24 h ± 2 h a 36 ℃ ± 1 ℃. Después de 24 h ± 2 h, observe si hay burbujas en el tubo invertido del tubo de ensayo. Aquellos que produzcan gas se someterán a una prueba de refermentación. Si no se produce gas, continuarán el cultivo durante 48 h ± 2 h. someterse a una prueba de refermentación. Aquellos que no produzcan gas serán reportados como Coliformes negativos.
Prueba de refermentación: al realizar la prueba de refermentación, primero coloque el asa de inoculación en un esterilizador infrarrojo para esterilizar y luego use el asa de inoculación para tomar 1 asa de cultivo del LST productor de gas. tubo de caldo, trasplante en tubos de caldo de sales biliares de lactosa verde brillante (BGLB) Después de la inoculación, el asa de inoculación debe esterilizarse en un esterilizador a tiempo. Coloque el tubo de caldo de sal biliar lactosa verde brillante inoculado en la incubadora e incúbelo a 36°C±1°C durante 48h±2h. Después de la incubación a 36 ℃ ± 1 ℃ durante 48 h ± 2 h, observe la producción de gas. Si hay burbujas en el tubo invertido del tubo de ensayo, se cuenta como tubo positivo para coliformes; de lo contrario, se cuenta como tubo negativo para coliformes.
Cuatro informes de resultados
De acuerdo con el número confirmado de tubos positivos para coliformes LST, consulte la tabla de recuperación para conocer el número más probable de coliformes proporcionada en el apéndice de GB4789.3-2010. e informe cada valor de g (mL) de NMP de coliformes en la muestra.
Segundo método:
Procesamiento de la muestra: Las muestras sólidas deben triturarse completamente en condiciones estériles. Esta demostración toma como ejemplo la leche en polvo, tomando una muestra en buenas condiciones de sellado y reservándola para su análisis.
Proceso de prueba:
Haga una marca en el tubo de ensayo estéril que contiene 9 ml de solución salina fisiológica, utilice una pajita estéril de 1 ml para extraer 1 ml de la solución homogénea de muestra 1:10 y lentamente agréguelo a lo largo de la pared del tubo. Inyéctelo lentamente en un tubo de ensayo estéril que contenga 9 ml de solución salina fisiológica. La boca del tubo de ensayo debe quemarse por un momento en una lámpara de alcohol antes y después de la dilución. Después de agregar el tapón, mezcle uniformemente en el oscilador para obtener una solución homogénea de muestra 1:100. De la misma manera, siga las operaciones anteriores para preparar una serie de diez veces de soluciones homogéneas de muestra diluidas. Al diluir la muestra, tenga cuidado de que la punta de la pipeta o punta no toque el nivel de diluyente. Para cada dilución incremental, utilice una pipeta o punta estéril de 1 ml;
Inoculación y cultivo: Marcar el fondo de la placa de petri que ha sido previamente esterilizada. Según la estimación de la contaminación de la muestra, seleccione de 2 a 3 diluciones en serie apropiadas. Esta demostración solo utiliza diluciones de muestra 1:10 y 1:100.
Utilice una pipeta estéril para absorber 1 ml de la dilución de muestra 1:10, agréguelo a la placa de Petri y reserve. De la misma manera agregar dilución 1:100 y solución blanco. Tenga en cuenta que cada dilución debe inocularse en 2 placas de Petri estériles. La solución en blanco debe reemplazar 1 ml de dilución de muestra con 1 ml de solución salina fisiológica.
Después de añadir la dilución del gradiente de muestra, se puede verter el medio de cultivo. Antes de verter, se debe quemar completamente la boca del matraz Erlenmeyer en una lámpara de alcohol. Después de quemar, vierta rápidamente de 15 ml a 20 ml de agar de sal biliar rojo neutro violeta cristal en cada placa de Petri, gire con cuidado la placa de Petri y mezcle bien el medio de cultivo y el líquido de muestra. Al verter el medio de cultivo, la boca del matraz cónico debe extenderse hacia la placa de Petri tanto como sea posible para evitar que el medio de cultivo cuelgue de la pared interior o exterior de la placa de Petri durante el vertido. El proceso de vertido debe ser decisivo. Evite que el medio de cultivo fluya o gotee a lo largo de la pared exterior del matraz Erlenmeyer. La temperatura adecuada del medio de cultivo es 46°C. No puede ser demasiado alta ni demasiado baja. Una temperatura demasiado alta no favorece el funcionamiento y es perjudicial para las bacterias. Si la temperatura es demasiado baja, el medio de cultivo se solidifica rápidamente. las bacterias no se pueden distribuir uniformemente en la placa de Petri, lo que provoca dificultades para contar las colonias. La fuerza debe ser uniforme al girar el medio de cultivo para evitar que el medio de cultivo toque la tapa de la placa de Petri o se derrame.
Después de verter el medio de cultivo, dejar reposar la placa de Petri y esperar a que el medio de cultivo se enfríe y solidifique.
Después de que el medio de cultivo se solidifique, agregue de 3 a 4 ml de agar de sales biliares rojo neutro violeta cristal para cubrir la superficie de la placa. El objetivo principal de agregar medio de cultivo dos veces es hacer que las bacterias crezcan dentro del medio de cultivo para que se pueda observar la morfología típica de la colonia. Espere a que el medio se enfríe y solidifique. Después de que el medio de cultivo se solidifique, dé la vuelta a la placa y colóquela en una incubadora durante 18 h a 24 h a 36 °C ± 1 °C.
Recuento de colonias en placa: Seleccione una placa con un recuento de colonias entre 15 UFC y 150 UFC, y cuente las colonias coliformes típicas y sospechosas que aparecen en la placa. Las colonias típicas se caracterizan por un color rojo púrpura y rojo alrededor de la placa. colonias. El anillo de precipitación de sales biliares tiene un diámetro de colonia de 0,5 mm o más.
Experimento de confirmación: Primero marca el tubo de caldo de sales biliares lactosa de color verde brillante. Esterilice el asa de inoculación en un esterilizador infrarrojo, luego use el asa de inoculación para seleccionar 10 tipos diferentes de colonias típicas y sospechosas de la placa de agar de sal biliar roja neutra violeta cristal y trasplántelas en carne de sal biliar con lactosa verde brillante respectivamente en la sopa. tubo, agite uniformemente. El asa de inoculación debe esterilizarse en un esterilizador inmediatamente después de cada inoculación. Coloque el tubo de caldo de sal biliar lactosa verde brillante inoculado en una incubadora e incúbelo a 36 °C ± 1 °C durante 24 h a 48 h. Una vez completado el cultivo, observe la producción de gas en el tubo de caldo de lactosa y sales biliares de color verde brillante. Si hay burbujas de aire en el tubo, se puede informar como coliforme positivo.
Cuatro informes de resultados
La proporción de tubos de ensayo que finalmente se confirma que son positivos para coliformes se multiplica por el número de colonias de placa contadas y luego se multiplica por el factor de dilución, que es la muestra por g (mL) Recuento de coliformes medio.