Interferencia de ARN; receptor de angiotensina ⅱ; vector shRNA altamente eficiente dirigido al silenciamiento de genes grandes y detección del receptor AT1 de ratón
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Resumen Propósito: Estudiar el efecto regulador del ARN de horquilla corta (shrna) en la expresión del gen del receptor de angiotensina ⅱ 1 (en 1) de rata en células de mamíferos y explorar la correlación entre las características de shRNA y shRNA eficientes. función. Métodos: Se construyeron cuatro vectores de expresión de shRNA dirigidos al receptor ⅱ de angiotensina de rata. Los shRNA se dirigen a 4 regiones diferentes del mismo gen. Se transfectaron células de glioma C6 de rata con el plásmido pGenesil1shRNA construido y el plásmido codificado. Las células cultivadas se recogieron en diferentes etapas para RTPCR y análisis de transferencia Western. Resultados: Después de 24 horas, no hubo una disminución significativa en los niveles de ARNm de AT1 en todos los grupos de tratamiento. Después de 48 horas, el nivel de ARNm de AT1 en el grupo tratado con plomo cayó al del grupo de control (55,7 ± 7,6) y alcanzó el punto más bajo (43,7 ± 8,2) después de 72 horas. Los otros grupos no tuvieron ningún efecto inhibidor significativo sobre la expresión del ARNm del receptor AT1 (P>0,05). Los niveles de ARNm y proteína de AT1 finalmente se comportaron de manera similar. A las 24 y 48 horas, la proteína AT1 fue (46,9±4,2) y (37,0±3,7) en comparación con el grupo control, respectivamente, y la reducción máxima se observó después de 72 horas de incubación [28,1 en comparación con el grupo control] ±4,0 )〕. Conclusión: Aparte de algunas reglas generales, creemos que la estructura de bucle de la región dirigida al ARNip del ARNm y una mejor accesibilidad del ARNip dirigido al ARNm tienen un fuerte impacto en el silenciamiento.
Palabras clave Hipertensión ARNi; receptor de angiotensina ⅱ; vector
Objetivo: Estudiar la regulación de la efectividad del gen del receptor de angiotensina ⅱ 1 de rata por shRNA en células de mamíferos y explorar la relación entre la Características de la función efectiva de shRNA y shRNA. Métodos: Se diseñaron y construyeron cuatro vectores de expresión de shRNA dirigidos a diferentes regiones del gen del receptor AT1 de rata, y luego se transfectaron en células C6 de glioma de rata, y las células transfectadas se recolectaron en diferentes momentos. Realizar RTPCR y Western blot. Resultados: 24 horas después de la transfección, los niveles de ARNm de AT 1 no se redujeron significativamente en todos los grupos de tratamiento. En comparación con el grupo de control, 48 horas después de la transfección, el nivel de ARNm del receptor de angiotensina ⅱ en el grupo Pb disminuyó a (55,7 ± 7,6). Alcanzó el punto más bajo (43,7±8,2) después de 72 h. No hubo ningún efecto inhibidor significativo sobre la expresión del ARNm del receptor AT1 en otros grupos (P > 0,05). Los resultados de la inhibición del gen del ARNm del receptor de angiotensina ⅱ de rata y su proteína fueron similares. En comparación con el grupo de control, la proteína del receptor de angiotensina II en el grupo teñido con plomo disminuyó a (46,9 ± 4,2) y (37) a las 24 h y 48 h, respectivamente. La reducción máxima 72 h después de la transfección fue (28,1 ± 4,0) ± 4,0). Conclusión: Además de los principios generales, la estructura circular del ARNm objetivo y si el shRNA puede alcanzar el sitio objetivo desempeñan un papel importante en el éxito de los experimentos de interferencia genética.
Interferencia de ARN; hipertensión; receptor de angiotensina ⅱ; vector
La interferencia genética puede degradar específicamente el ARNi del gen objetivo, reduciendo o silenciando la expresión del gen objetivo en tejidos o células. 1]. Se seleccionaron y sintetizaron varios nucleótidos monocatenarios que codifican el ARNm de horquilla corta (shRNA) del ARNm de AT1R de rata, se hibridaron para formar una estructura bicatenaria y se clonaron en un vector plasmídico. Después de construir cuatro vectores de expresión que codifican shRNA AT1R, se transfectaron células C6. Basándose en la expresión funcional de plásmidos de shRNA con diferentes secuencias de nucleótidos en células de mamíferos, se estudiaron las diferencias en sus efectos de orientación para silenciar el AT1R de rata.
1 Materiales y métodos
1.1 El plásmido se adquirió de Wuhan Jingsai Bioengineering Technology Co., Ltd., y las enzimas de restricción BamH, Hind, Sal y Pst se adquirieron de Dalian. Bao Bioengineering Co., Ltd. Company; la ADN ligasa T4 y el tampón se adquirieron de New England Biolabs. Las células C6 de la línea celular de glioma de rata se adquirieron en China Type Herbarium; el medio de cultivo celular DMEM se adquirió en Hyclone Company. El reactivo de transfección Metafectamine se adquirió de Biotex, Alemania. Todos los servicios de síntesis de ADN y síntesis de cebadores son proporcionados por Shanghai Boya Biotechnology Co., Ltd.
Método 1.2
Construya shRNA del ARNm AT1R del gen objetivo 1.2.1 en GenBank, seleccione AT1R de rata (Para la secuencia del gen (número de secuencia NM_030985), utilice la herramienta de orientación de ARNip del software de diseño en línea para seleccionar una secuencia de 21 nucleótidos de longitud y que termine en TT. El contenido de GC no debe exceder 60 como máximo. Las cuatro secuencias de nucleótidos del gen diana con cuatro o más bases A o T consecutivas se eliminaron y verificaron mediante BLAST, y el ADN monocatenario de secuencia directa e inversa que codifica la secuencia de shRNA se sintetizó químicamente de la siguiente manera: un par de secuencias no específicas fueron diseñados simultáneamente para apuntar a secuencias de nucleótidos de genes como controles positivos. La secuencia de shRNA sintetizada se recoció, se ligó con el plásmido pGenesil1 linealizado, se transformó en clones positivos y se identificó mediante digestión y secuenciación enzimática Pstⅰⅰ y Salⅰⅰ. Los diferentes plásmidos de secuencia de genes diana mencionados anteriormente se denominan respectivamente pGenesilA (Pa), pGenesilB (Pb), pGenesilC (Pc) y pGenesilD (Pd).
1.2.2 Cultivo celular y transfección: Inocular el mismo número de células en la placa de cultivo a una densidad de 2×108/L, y transfectar las células en una proporción de 1:6 según la transfección. protocolo del proveedor de reactivos.
1.2.3 La secuencia del cebador del gen RTP Crat1 es: 5’tgttcctcttccttatcatttct 3’, 5’ctttgcttggttatact.
Las secuencias de cebador de CCT TCA 3’ y GAPDH de referencia interna son: 5’ttcaaggcacagtcaag 3’, 5’ttagtggggtct respectivamente.
CGC TCC 3’. El volumen de reacción de 25 µL incluye 5 µL de ADNc, 0,25 µL de cada cebador, 1,5 µL de MgCl2, 0,25 µL de ADN polimerasa Taq, 0,5 µL de mezcla de dNTP y 5 µL de tampón 10X. Las condiciones de reacción son: recocido a 94°C durante 3 minutos, luego recocido 65438 a 94°C. Después de realizar 30 ciclos a 55°C durante 15 s y 72°C durante 15 s, los productos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa.
1.2.4 El análisis de transferencia Western mostró que las células C6 se recolectaron en diferentes momentos después de la transfección con el plásmido pGensilAT1shRNA y el plásmido de control. Después de lavar con solución de PBS, las células se lisaron cargando solución tampón. Después de hervir la solución durante 65438±00 minutos, centrifugar el sobrenadante y descartar el precipitado. Determinar la concentración de proteínas. Los lisados celulares se separaron mediante electroforesis. Después de sellar con 50 g/L de leche desnatada, agregar el anticuerpo anti-AT1 (1:1000) y el anticuerpo anti-β-actina (1:1500), incubar a temperatura ambiente durante 1,5 h y luego agregar el segundo anticuerpo (anti-actina). HRP de conejo).
Procesamiento estadístico: De acuerdo con los resultados del análisis RTPCR y Western Blot, se utilizó el software de procesamiento de imágenes ImageTool 3.0 para medir el valor de gris y el valor relativo se comparó con la referencia interna. Se utilizó el software estadístico SPSS 11.5 para realizar análisis de varianza entre grupos. El nivel de significancia es p < 0,05.
2 resultados
2.1 Diferentes dianas plasmídicas de expresión de shRNA y estructuras secundarias. Seleccionamos una secuencia parcial de la secuencia de ARNm del receptor de angiotensina ⅱ de rata, es decir, 556 ~ 575 pb. Se construyeron cuatro secuencias. 469~488 pb, 595~614 pb y 663~682 pb, como objetivos de silenciamiento genético (Figura 1).
Excepto por la falta de dos timidinas consecutivas en el extremo 3', la cadena sentido del shRNA AT1 tiene la misma secuencia que el gen diana del gen AT1 de rata, y la cadena antisentido es complementaria a la diana. secuencia. Se espera que el ARN producido por su transcripción se pliegue en un ARNip corto en forma de horquilla. En teoría, el shRNA transcrito debería poder escindir el ARNm del gen objetivo, pero el plásmido de control mezclado no debería usarse para AT 65438.
2.2 Nivel de ARNm de AT1 y expresión de proteínas Después de la transfección con cuatro grupos de plásmidos positivos durante 24 horas, no hubo una disminución significativa en los niveles de ARNm de AT1 en cada grupo. Después de 48 horas, en comparación con el grupo de control, el nivel de expresión del ARNm de AT1 en el grupo transfectado con plásmido Pb disminuyó a (55,7 ± 7,6). El nivel de expresión del ARNm del receptor AT1 en células de glioma C6 transfectadas con ARNip recombinante no se inhibió significativamente (P gt0.05). Los resultados mostraron que el plásmido Pb inhibió significativamente la expresión del ARNm del receptor AT1, mientras que los otros tres grupos de plásmidos la inhibieron. El ARNm del receptor AT1 no tuvo ningún efecto evidente (Figura 3 y Figura 4). Análisis de transferencia Western de plásmidos Pb con potentes efectos inhibidores sobre el ARNm del receptor AT1. A las 24 h y 48 h, la expresión de la proteína AT1 fue (46,9 ± 4,2) y (37,0 ± 3,7) respectivamente. En comparación con el grupo de control, el nivel de expresión máximo disminuyó 72 h después de la transfección (solo (28,65438 ± 0,4) en el grupo de control. Los resultados mostraron que el nivel de proteína de AT1 se redujo en las células transfectadas con plásmido Pb, pero el nivel de proteína). de AT1 se redujo en células transfectadas con plásmido shRNA mezclado y el grupo de control no pudo reducir la expresión del gen AT1 (Fig. 5). Todos los resultados muestran claramente que la transfección con plásmido Pb puede inhibir la expresión del gen AT1.
La angiotensina II es la principal molécula efectora del sistema renina-angiotensina y tiene funciones en la regulación de la presión arterial, el equilibrio de agua y sodio y la función neurológica. Los estudios han confirmado que la angiotensina II está involucrada en la patología de la arteriosclerosis, el infarto de miocardio. remodelación vascular y miocárdica e insuficiencia cardíaca congestiva. La angiotensina II induce hipertrofia y proliferación de células vasculares activando directamente AT1R y estimulando indirectamente la liberación de algunos factores de crecimiento y citocinas [2]. de AT1 Provoca vasodilatación, aumenta la producción de bradicinina e inhibe la fibrosis y la remodelación vascular [3]. Este estudio construyó un plásmido de expresión de ARN en forma de horquilla corta para AT1 y utilizó tecnología de silenciamiento genético para inhibir la expresión del ARNm de AT1 en células de mamíferos.
Los resultados experimentales muestran que la expresión de ARNm del gen AT1 disminuye en la etapa temprana, y la proteína correspondiente también disminuye con la supresión del nivel de ARNm. Los resultados muestran que la secuencia de shRNA impulsada por el U6. El promotor puede ser efectivo y eficaz. Inhibe específicamente la expresión del gen AT1 en células C6 transfectadas. Por lo tanto, la expresión de shRNA puede inhibir la expresión del gen AT1 en células relacionadas con la fisiopatología de la hipertensión. no existe * * * opiniones ni criterios para seleccionar secuencias de ARNip [5] Para optimizar la eficiencia del silenciamiento de genes inducido por ARNip, muchos grupos de investigación han estudiado la longitud, la estructura secundaria y la especificidad de secuencia de los dúplex de ARNip [6]. En general, se cree que las secuencias de ARNip deben seleccionarse después de 100 bases aguas abajo del codón de inicio del gen diana, la secuencia del ARNip debe evitar la región no codificante 5' o 3' del codón de inicio. de la cadena sentido debe ser AA(N19)TT, donde N representa cualquiera de los nucleótidos, es decir, el ARNip seleccionado debe tener dos salientes 3' de nucleósidos de uridina. La longitud del ARNip seleccionado debe ser de 21 nucleótidos. que determinan el éxito de los estudios de interferencia de ARN.
Incluyendo la posición del sitio objetivo en la estructura terciaria del ARNm, la eficiencia de la transfección y la especificidad del ARNhc bicatenario [7-8]. Al comparar los cuatro plásmidos diseñados en este experimento, notamos que los sitios de escisión específicos de Pc y Pd están ubicados en el centro de la estructura secundaria del ARNm del gen objetivo, especialmente Pd. Esta puede ser una de las razones por las que el ARN en horquilla corta producido por la transfección del plásmido no puede ingresar al sitio de escisión del ARNm objetivo después de unirse a RISC (complejo de silenciamiento de genes inducido por ARN), lo que lleva al fracaso del experimento. Los sitios de escisión objetivo de Pa y Pb se encuentran en la superficie de la estructura secundaria del ARNm del gen objetivo, pero el plásmido Pa también es ineficaz. Las posibles razones son: ① El bajo contenido de GC del plásmido Pa reducirá la eficiencia de reconocimiento del ARNm del gen objetivo. ② Se reduce la eficiencia de la hibridación con RISC. Además, también encontramos que la estructura secundaria local del gen objetivo escindido por el plásmido Pb era más laxa que la del plásmido Pa, es decir, los enlaces de hidrógeno en el sitio objetivo del primero eran relativamente más débiles que los del segundo. . Entre estos factores, creemos que los más importantes son si el ARNip puede ingresar al sitio objetivo y si la estructura del ARNm del sitio objetivo es lo suficientemente suelta como para permitir la escisión dirigida del complejo ARNip y RISC.
En resumen, al diseñar ARN en horquilla corta, además de que la secuencia objetivo esté dentro del marco de lectura abierto, no seleccione regiones no codificantes, el contenido de GC debe ser de alrededor de 50 bases; después de la base del codón de inicio, además de encontrar la secuencia 5′aa (n 19) y realizar BLAST y algunas otras reglas generales [9], creemos que si el ARNip puede ingresar al sitio de corte objetivo y si la estructura secundaria del objetivo; El sitio está suelto son criterios razonables para un shRNA eficaz. El factor más importante para un diseño y experimentación exitosos.
Referencia
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[3] La expedición ha finalizado. ¿Tienen los receptores de angiotensina II tipo 2 efectos nocivos sobre las enfermedades cardiovasculares? Implicaciones del bloqueo terapéutico del sistema renina-angiotensina. Circulación, 2004, 109(1): 8-13.
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