Su capacidad para sintetizar proteínas incluye ribosomas, ARNt y otras moléculas necesarias para la síntesis y síntesis de proteínas. Luego agregue el ARNm y 20 aminoácidos esenciales, de los cuales Met está marcado con 35S. El ARNm se transcribe en una mezcla de proteínas radiactivas que pueden separarse mediante electroforesis y visualizarse mediante autorradiografía. Cada banda representa una proteína traducida del ARNm.
HRT y HART funcionan bien en presencia de clones de ADNc. En la TRH, primero se desnaturaliza el ADNc, se combina con una membrana de celulosa o una membrana de nailon, y se agrega una muestra de ARNm para que el ARNm específico que se hibrida con el ADNc permanezca en la membrana. Después de eliminar las moléculas no unidas, el ARNm se puede recolectar y agregar al sistema extracelular, que producirá la proteína específica codificada por el ADNc.
La diferencia con HART es que HART no elimina las moléculas no hibridadas, sino que transfiere toda la membrana al sistema extracelular. El ARNm hibridado no se puede traducir directamente, por lo que se traduce todo el ARNm. Se pueden identificar las proteínas que faltan en los productos de traducción.
2. Sistema de traducción sin celdas.
Los sistemas de traducción libre de células comúnmente utilizados en los laboratorios incluyen extracto de semilla de germen de trigo y reticulocitos de conejo, y algunos [1] utilizan el sistema de ovocitos de Xenopus laevis. El sistema de traducción libre de células incluye principalmente:
(1) Ribosoma
(2) ARNt
(3) 20 tipos de aminoácidos, uno; de los cuales tiene marcaje radiactivo (35S-metionina
(4) controla factores relacionados con la síntesis de proteínas.
El sistema de traducción libre de células tiene las siguientes tres ventajas:
(1) En el sistema de traducción libre de células, la actividad de síntesis de proteínas es extremadamente alta.
El sistema de traducción libre de células es una "máquina sintética" de proteínas artificiales cuya función es sintetizar proteínas en comparación. con el sistema tradicional de traducción bacteriana del huésped, el sistema de traducción libre de células no necesita considerar la viabilidad de la bacteria huésped en sí, solo necesita sintetizar una gran cantidad de la proteína objetivo, que es extremadamente eficiente [2]; /p>
(2) Traducción específica de la secuencia del gen diana
Igual que (1), el sistema de traducción libre de células no se ve interferido por la bacteria huésped. Suponiendo que sea un X recombinante, si. Si se agrega el sistema de traducción libre de células, el sistema solo traducirá una secuencia de ácido nucleico limitada en el recombinante, lo cual es conveniente [lunwen. nangxue.com, Paper Network] Analiza el gen objetivo y su producto de expresión. el recombinante Esto traerá grandes inconvenientes al análisis
(3) La adición de aminoácidos marcados radiactivamente es beneficiosa para la detección de productos de traducción
Como un medio importante de genética; investigación de ingeniería, traducción libre de células La función principal del sistema es la síntesis dirigida de la proteína deseada y la detección generalmente se agregan al sustrato de aminoácidos del sistema, o se usa 35S-metionina para facilitar la post-metionina. detección traslacional [3].>3.HRT y HART
Las ideas técnicas de HRT y HART son las mismas. El contenido principal es utilizar el ARNm del gen objetivo como objeto operativo y detectar la presencia. o ausencia de su producto de expresión mediante autorradiografía. Los pasos clave son: Obtener el ADNc del gen diana como plantilla y utilizarlo como sonda para la detección de hibridación.
En HRT, después de que el gen objetivo esté conectado al vector, se realizarán las siguientes operaciones:
(1) Agregar el recombinante conectado al sistema de traducción libre de células para su transcripción y expresión, y extraer el ARNm
(2) Sacar parte del ARNm extraído, diseñar cebadores utilizando el gen diana como plantilla y realizar RT-PCR utilizando el ARNm como sustrato para obtener el ARNm; secuencia del gen objetivo del ADNc;
(3) Fijar el ADNc en una membrana de nitrocelulosa o nailon como sonda de hibridación;
(4) Mezclar el ARN restante con el ADNc, incubar y luego realizar una elución no específica, es decir, controlando la reacción de elución. Lavar las moléculas de ARN que no se hibridan específicamente con el ADNc en las condiciones;
(5) Cambiar las condiciones de elución para realizar una elución específica; Hay una unión específica entre la molécula de ARNm y el ADNc, el ARNm se eluirá en este paso y este ARNm es el producto de transcripción del gen diana.
(6) Recoger los productos de elución, añadirlos al sistema de traducción libre de células y detectar los productos de expresión mediante electroforesis de proteínas y autorradiografía.
Obviamente, debido al uso de un sistema de traducción libre de células y a la eliminación de una gran cantidad de moléculas de ARNm irrelevantes para el experimento de detección, solo hay dos resultados experimentales para la TRH:
(1) Solo hay una tira radiactiva. La banda es el producto de expresión final del gen diana. Los resultados mostraron que el gen diana se conectó con éxito al vector y se transformó, y pudo transformarse con éxito en la bacteria huésped.