La investigación para mejorar la resolución de los microscopios ópticos se centra principalmente en dos aspectos. Una es utilizar métodos clásicos para mejorar la resolución espacial en diversas condiciones, como la tecnología SPIM para la investigación de muestras gruesas, la tecnología SHG para mediciones rápidas y la tecnología MPM para la investigación de células vivas. El segundo es combinar la última tecnología no lineal con tecnología de medición de alta apertura numérica (como la tecnología STED y SSIM). La investigación científica biológica es inseparable del apoyo de la tecnología de microscopía de ultra alta resolución, y la gente necesita urgentemente actualizar la tecnología de microscopía para adaptarla a los requisitos del desarrollo de los tiempos. Las investigaciones de los últimos años han demostrado que la resolución de los microscopios ópticos ha superado con éxito el límite de difracción de una resolución lateral de 200 nm y una resolución axial de 400 nm. El desarrollo de microscopios ópticos de alta resolución e incluso de ultra alta resolución no es sólo un avance de la tecnología en sí, sino que también promoverá en gran medida el estudio de muestras biológicas y proporcionará nuevos medios para la investigación a nivel subcelular y molecular.
Microscopía óptica; alta resolución; tecnología no lineal; nanoescala
La microscopía ha desempeñado un papel importante en el desarrollo de la biología, especialmente algunos descubrimientos importantes contribuyeron directamente. el gran avance de la biología celular y disciplinas relacionadas. La observación de estructuras y procesos biológicos en muestras fijas y vivas hace que la microscopía óptica sea un instrumento esencial para la mayoría de las investigaciones en ciencias biológicas. A medida que la investigación en ciencias biológicas se desarrolla desde especies enteras hasta el nivel molecular, la resolución espacial de los microscopios y su capacidad para resolver detalles finos se ha convertido en una cuestión técnica muy crítica. La historia del desarrollo de los microscopios ópticos es la historia de la humanidad desafiando constantemente el límite de resolución. En el rango de luz visible de 400 ~ 760 nm, el límite de resolución del microscopio es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la onda de luz, aproximadamente 200 nm, y el límite alcanzado por los últimos resultados de la investigación es 20 ~ 30 nm. Este artículo revisa los principios técnicos de la microscopía óptica de alta resolución y el progreso de la investigación en los últimos años para superar el límite de difracción de la luz desde dos aspectos: microscopía tridimensional de alta resolución y microscopía de superficie de alta resolución.
1 Resolución de los microscopios ópticos tradicionales
El tamaño de la imagen de un microscopio óptico depende principalmente de la longitud de onda de la luz y del tamaño limitado de la lente del objetivo del microscopio. La distribución del brillo de un objeto similar a una fuente de luz puntual en el espacio de la imagen se denomina función de dispersión puntual (PSF) de un sistema óptico. Dado que las características del sistema óptico y la naturaleza de la luz emitida determinan que el microscopio óptico no es un verdadero sistema invariante de traslación lineal, el PSF generalmente se distribuye radialmente simétricamente en el plano x-y perpendicular al eje óptico, pero tiene una expansión obvia a lo largo el eje óptico Z. Según el criterio de Rayleigh, la distancia mínima que se puede resolver entre dos puntos es aproximadamente igual al ancho de la función de dispersión de puntos.
Según el criterio de Rayleigh, el límite de resolución de los microscopios ópticos tradicionales se expresa mediante la siguiente fórmula [1]:
Resolución lateral (plano x-y): dx, y=■< / p>
Resolución del eje (a lo largo del eje Z): dz=■
Se puede observar que la mejora de la resolución de un microscopio óptico está restringida por la longitud de onda λ de la onda de luz y la apertura numérica N.A del microscopio. Cuanto más estrecho sea el PSF, mayor será la resolución del sistema de imágenes ópticas. Hay dos formas de mejorar la resolución: (1) Elija una longitud de onda más corta; (2) Para aumentar la apertura numérica, utilice materiales de alto índice de refracción.
El criterio de Rayleigh se basa en el supuesto de ondas que se propagan. Si se pudieran detectar campos no radiativos, sería posible superar las limitaciones del criterio de Rayleigh sobre la barrera de difracción.
Microscopio tridimensional de alta resolución
En el estudio de mejorar la resolución de los microscopios ópticos, es de gran importancia corregir las aberraciones y aberraciones cromáticas de los objetivos del microscopio. La calidad de las imágenes de los microscopios ópticos se ha mejorado significativamente desde el método general de combinación de lentes hasta el uso de diafragmas para limitar la luz no paraxial, desde la aberración acromática estable hasta la aberración apocromática y supercromática. Recientemente, Kam et al. [2] y Booth et al. [3] aplicaron el principio de la óptica adaptativa para llevar a cabo investigaciones relacionadas sobre la corrección de aberraciones microscópicas. El sistema de óptica adaptativa consta de un sensor de frente de onda, una lente anamórfica, una computadora, hardware de control y software especializado para medir continuamente las aberraciones del sistema del microscopio y corregirlas automáticamente. En términos generales, la microscopía tridimensional de alta resolución existente se puede dividir en tres categorías: * Microscopía de enfoque y deconvolución, microscopía de imágenes de interferencia y microscopía no lineal.
2.1 ***Microscopía Focalizada y Microscopía de Convolución Los métodos más maduros para resolver la obtención de imágenes microscópicas de muestras biológicas gruesas son la ***Microscopía Focalizada[4] y la microscopía de deconvolución tridimensional (3-DDM). ) [5], ambos métodos se pueden utilizar sin preparar secciones físicas de la muestra.
* * *La característica principal de la microscopía de enfoque es mejorar el contraste de la imagen mediante el uso de un orificio de detección para eliminar la fluorescencia producida por objetivos fluorescentes que no están en el plano focal. * * *El PSF del microscopio de enfoque es el cuadrado del PSF del microscopio convencional y la resolución mejora aproximadamente ■ veces. Para obtener imágenes satisfactorias, la tecnología de enfoque tridimensional a menudo requiere el uso de luz de excitación de alta intensidad, lo que produce decoloración del tinte y fototoxicidad para las muestras biológicas vivas. Además, la estructura es compleja y costosa, lo que limita en cierta medida su aplicación.
3-DDM utiliza un software para procesar toda la secuencia de corte óptico. En comparación con el microscopio de enfoque **, esta tecnología utiliza luz de excitación de baja intensidad, que reduce el fotoblanqueo y la fototoxicidad, y es adecuada para estudiar muestras biológicas vivas durante mucho tiempo. El sensor CCD científicamente refrigerado se utiliza para detectar fotones simultáneamente en el plano focal y cerca del plano desenfocado. Tiene un amplio rango dinámico y un largo tiempo de exposición, lo que mejora la eficiencia óptica y la relación señal-ruido de la imagen. El 3-DDM ha ampliado los campos de aplicación de la microscopía de fluorescencia de campo amplio tradicional y ha atraído una amplia atención en el campo de las ciencias biológicas [6].
2.2 Microscopía de iluminación de plano selectivo Basándose en las características de absorción y dispersión de la luz de grandes muestras biológicas vivas, Huisken[7] et al desarrollaron la microscopía de iluminación de plano selectivo (SPIM). A diferencia de la forma habitual de cortar y fijar muestras en portaobjetos de vidrio, SPIM puede observar muestras biológicas vivas más grandes, de 2 a 3 mm, en un estado casi natural. SPIM forma una capa de luz ultrafina a través de una lente cilíndrica y una ventana óptica delgada, mueve la muestra bajo una iluminación de capa ultrafina para obtener imágenes de corte y también puede escanear y obtener imágenes de la muestra en diferentes ángulos de observación a través del escenario giratorio. logrando así una reconstrucción de imágenes 3D de alta calidad. Debido al uso de capas de luz ultrafinas, SPIM reduce el daño de la luz a las muestras biológicas vivas, lo que permite que las muestras intactas sigan sobreviviendo y creciendo, lo que actualmente es imposible con otros microscopios ópticos. La aparición de la tecnología SPIM proporciona una herramienta microscópica adecuada para observar fenómenos biológicos transitorios en grandes muestras vivas y es de especial importancia para la investigación de la biología del desarrollo y la observación de la estructura tridimensional de las células.
2.3 Tecnología de iluminación estructurada e imágenes de interferencia Cuando se utiliza microscopía de fluorescencia para obtener imágenes de muestras biológicas gruesas con objetivos de alta apertura numérica, el seccionamiento óptico es un método ideal para obtener datos tridimensionales de alta resolución, incluyendo * * * microscopía enfocada, microscopía de deconvolución tridimensional y microscopía de disco de Nipkow. La microscopía estructurada basada en iluminación, informada por Neil et al. en 1997, es una nueva tecnología que utiliza microscopía de fluorescencia convencional para lograr el corte óptico y puede obtener la misma resolución axial que la microscopía de enfoque. La aplicación de la tecnología de imágenes de interferencia en microscopía óptica fue propuesta por primera vez por Lanni et al. en 1993, y se desarrolló aún más con la aplicación de tecnologías de microscopía I5M, HELM y 4Pi. La fluorescencia emitida registrada mediante técnicas de imágenes de interferencia transporta información de mayor resolución que la fluorescencia observada mediante microscopía de fluorescencia convencional. (1) Tecnología de luz estructurada: combina sistemas de hardware y sistemas de software especialmente diseñados. El hardware incluye una patineta estructurada en cuadrícula y su controlador, y el software implementa el control del sistema de hardware y el cálculo de imágenes. Para generar secciones ópticas, se adquieren con un CCD imágenes de proyección sin procesar correspondientes a diferentes posiciones de las líneas de la cuadrícula. Mediante el cálculo del software, se obtiene una imagen clara sin fluorescencia parásita de la superficie desenfocada y el contraste y la claridad de la imagen mejoran significativamente. El uso de la tecnología de tomografía óptica de iluminación estructurada resuelve los problemas de interferencia de la luz dispersa de la superficie desenfocada, la reconstrucción que requiere mucho tiempo y el largo tiempo de cálculo en la tomografía óptica 2D y las imágenes de fluorescencia tridimensional. El espesor de la sección óptica de la tecnología de iluminación estructurada puede alcanzar los 0,01 nm, la resolución axial es 2 veces mayor que la de los microscopios de fluorescencia convencionales y la velocidad de imágenes 3D es 3 veces mayor que la de los microscopios enfocados. (2) Microscopio 4Pi: El microscopio 4Pi basado en el principio de interferencia es una extensión de la tecnología de microscopio de enfoque/dos fotones. El microscopio 4Pi está equipado con una lente objetivo confocal antes y después de la muestra, que puede obtener imágenes de alta resolución de tres maneras: ① La muestra se ilumina con la luz de interferencia generada por los dos frentes de onda (2) El detector detecta la interferencia; luz generada por los dos frentes de onda emitidos. Luz de interferencia; ③ Los frentes de onda de iluminación y detección son luz de interferencia. El microscopio 4Pi utiliza láser como fuente de iluminación en el modo de enfoque * * *, que puede proporcionar una resolución lateral espacial de menos de 100 nm, y la resolución axial es de 4 a 7 veces mayor que la tecnología de microscopio de fluorescencia enfocada * * *. Utilizando la tecnología de microscopía 4Pi, se pueden lograr imágenes de células vivas de ultra alta resolución. Egner et al. [8, 9] utilizaron múltiples haces paralelos y un dispositivo de dos fotones para observar los detalles finos de las mitocondrias, el aparato de Golgi y otros orgánulos en las células vivas.
Carl[10] utilizó microscopía 4Pi para medir por primera vez el tipo de canales iónicos Kir2.1 en la membrana celular de células HEK293 de mamíferos. Los resultados muestran que el microscopio 4Pi se puede utilizar para estudiar la estructura y morfología de las membranas celulares con resolución nanométrica. (3) Microscopía de interferencia de imagen (I2M): utilice dos objetivos de alta apertura numérica y un divisor de haz para recopilar imágenes de fluorescencia en el mismo plano focal e interferirlas en el plano CCD. En 1996, Gustafsson y otros utilizaron esta lente de doble objetivo para iluminar la muestra desde ambos lados con una fuente de luz incoherente (como una lámpara de mercurio) e inventaron la tecnología de microscopio I3m (microscopía de iluminación de interferencia incoherente, I3M) y combinada. con I2M, se forma la tecnología de microscopía I5M. Durante el proceso de medición, al escanear la muestra capa por capa en el plano focal para obtener una serie de imágenes y luego desconvolucionar adecuadamente los datos, se puede obtener información tridimensional de alta resolución. El rango de resolución del I5M está dentro de los 100 nm.
2.4 Microscopía no lineal de alta resolución Los fenómenos no lineales se pueden utilizar para detectar cantidades muy pequeñas de fluorescencia o incluso muestras sin marcar. Aunque algunas tecnologías aún se encuentran en la etapa de laboratorio físico, hay mucho espacio para el desarrollo cuando se combinan con la tecnología de microscopía tridimensional existente. (1) Microscopía de excitación multifotónica: (MPEM) es un tipo de microscopía que combina microscopía de enfoque y tecnología de fluorescencia de excitación multifotónica. No solo puede producir imágenes tridimensionales de alta resolución de muestras, sino que también básicamente resuelve el problema. de luz Problemas de decoloración y fototoxicidad. Durante la excitación multifotónica, la probabilidad de absorción no es lineal [11]. La fluorescencia se produce por la absorción simultánea de dos o incluso tres fotones, y la intensidad de la fluorescencia es proporcional al cuadrado de la intensidad de la fotoluminiscencia. Para la distribución láser cónica oblicua generada por el haz enfocado, la excitación multifotónica solo se puede realizar en el centro de la muestra, con capacidades inherentes de imágenes tridimensionales. Al absorber la dañina energía de excitación de onda corta, el daño a las células y tejidos circundantes se reduce significativamente, lo que convierte al MPEM en un medio poderoso para obtener imágenes de muestras biológicas gruesas. La resolución axial de MPEM es mayor que la de la microscopía enfocada y la microscopía de fluorescencia de deconvolución 3D. (2) Microscopía de pérdida de emisión estimulada: Westphal [12] recientemente implementó el concepto de imágenes de pérdida de emisión estimulada (STED) propuesto por Hell antes de 1994. Las imágenes STED aprovechan la relación no lineal entre la saturación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia por excitación. La tecnología STED utiliza dos láseres pulsados para garantizar que la cantidad de fluorescencia emitida en la muestra sea muy pequeña. El primer láser se utiliza como luz de excitación para excitar moléculas fluorescentes; el segundo rayo láser irradia la muestra y su longitud de onda puede hacer que las moléculas del material luminiscente vuelvan al estado fundamental inmediatamente después de ser excitadas. Aquellas moléculas fluorescentes en el foco que han sufrido pérdida de luz STED pierden la capacidad de emitir fotones de fluorescencia, y el área de fluorescencia emisora restante se limita a un área más pequeña que el límite de difracción, por lo que se obtiene un punto más pequeño que el límite de difracción. Hell et al. obtuvieron una resolución lateral de 28 nm y una resolución axial de 33 nm [12, 13], y separaron completamente dos moléculas similares a una distancia de 62 nm. Recientemente, la resolución axial de los microscopios STED y 4Pi ha sido tan baja como 28 nm, y se demostró por primera vez que la resolución axial de imágenes de proteínas inmunofluorescentes puede alcanzar los 50 nm [14]. (3) Microscopía de iluminación estructural saturada: Heintzmann et al. [15] propusieron la hipótesis teórica de la microscopía de iluminación estructural saturada, que es contraria al concepto de STED y recientemente fue verificada con éxito por Gustafsson et al. A medida que aumenta la intensidad de la luz, estos volúmenes se vuelven muy pequeños, más pequeños que el ancho de cualquier PSF. Con esta tecnología se han conseguido resoluciones inferiores a los 50 nanómetros. (4) Las imágenes de segunda generación armónica (SHG) utilizan radiación coherente de frecuencia duplicada generada por la interacción entre pulsos láser ultrarrápidos y medios como fuente de señal de imagen. Los SHG son generalmente un proceso no vibratorio. Los fotones solo se dispersan de forma no lineal en las muestras biológicas y no serán absorbidos, por lo que no habrá ningún proceso fotoquímico que lo acompañe, lo que puede reducir el daño a las muestras biológicas. Las imágenes SHG no requieren teñido y pueden evitar la fototoxicidad causada por el uso de tintes. Debido a su valor de aplicación único en mediciones no destructivas o observación dinámica a largo plazo de muestras biológicas, ha recibido cada vez más atención en el campo de la investigación en ciencias biológicas [17].
3 Microscopía de superficie de alta resolución
La microscopía de superficie de alta resolución se refiere a algunos microscopios que no se pueden usar para mediciones tridimensionales, sino que solo se pueden usar para mediciones bidimensionales de alta resolución. Mediciones de superficies. Incluye principalmente microscopio óptico de barrido de campo cercano, microscopio de fluorescencia de reflexión interna total, microscopio de resonancia de plasmón de superficie, etc.
3.1 El microscopio óptico de barrido de campo cercano (NSOM) es un microscopio óptico con resolución por debajo de la longitud de onda. Debido a que la distancia entre la fuente de luz y la muestra es cercana a los nanómetros, la resolución está determinada por el diámetro de la sonda óptica y la distancia entre la sonda y la muestra, independientemente de la longitud de onda de la fuente de luz. La resolución lateral de NSOM es inferior a 100 nm. Lewis [18] obtuvo una resolución de menos de 10 nm controlando el muestreo a una determinada frecuencia de vibración de la punta. NSOM tiene una relación señal-ruido muy alta y puede medir rápidamente 100 imágenes por segundo [19]. NSOM se ha utilizado para imágenes de fluoróforos únicos y análisis espectroscópicos en membranas celulares.
3.2 Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total Después del descubrimiento de la proteína fluorescente verde y sus derivados, la tecnología de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) ha recibido más atención y aplicación. Al utilizar ópticas especiales de iluminación de muestras, TIRF puede proporcionar una alta resolución axial. Cuando la muestra se coloca en un cubreobjetos cerca del prisma, se evita la exposición directa de la luz a la muestra biológica ya que se produce una reflexión interna total. Sin embargo, debido al efecto de onda, todavía habrá una pequeña cantidad de energía que pasará a través de la interfaz entre el portaobjetos y el medio líquido para iluminar la muestra. El brillo de estas luces es suficiente para formar un área oculta de luz de 100 nm en el. capa delgada cerca del portaobjetos y excita esta capa poco profunda de moléculas fluorescentes [20]. La fluorescencia excitada es adquirida por la lente del objetivo para obtener una alta resolución axial cercana a los 100 nm. TIRF se ha aplicado recientemente al campo de investigación de la dinámica de la marcha por movimiento molecular en combinación con tecnología de iluminación de interferencia, con una resolución de 8 nm y una resolución temporal de 100 μs [21].
3.3 Resonancia de plasmón superficial* * *La resonancia de plasmón superficial (SPR) [22] es un fenómeno físico óptico. Cuando el ángulo de incidencia golpea la interfaz de dos medios transparentes diferentes en un ángulo crítico, se produce una reflexión total y la intensidad de la luz reflejada debe ser la misma en todos los ángulos. Sin embargo, si se coloca una película de metal sobre la superficie del medio, la luz incidente se acoplará a los plasmones de la superficie, lo que hará que los electrones vibren mucho, lo que provocará que la luz reflejada se debilite enormemente dentro de un cierto ángulo. La luz reflejada desaparece por completo se llama ángulo de vibración. * * *El ángulo de vibración cambiará con el índice de refracción del líquido que fluye sobre la superficie de la película metálica. El cambio en el índice de refracción es proporcional a la masa de las biomoléculas unidas a la superficie del metal. Midiendo el cambio en la intensidad de la luz refractada en la superficie del recubrimiento, se pueden obtener pequeños cambios en el índice de refracción de la superficie.
Desde que Fagerstan et al. la utilizaron para el análisis de interacciones bioespecíficas en 1992, la tecnología SPR se ha aplicado al análisis y detección de interacciones bioespecíficas ADN-ADN, monitoreo de células microbianas y estudios mecanicistas y análisis cuantitativos de. la afinidad y especificidad de las toxinas bacterianas por los receptores de glicolípidos [23]. Cuando la información SPR se transmite a través de poros a nanoescala [24], proporcionando un rendimiento óptico excelente, es posible desarrollar un microscopio principal de imágenes completamente nuevo combinando la tecnología SPR con dispositivos nanoestructurados.
Referencia
[1] Tang Lemin, Ding Fei. Procesamiento y análisis de imágenes en ciencias biológicas[M]. Beijing: Science Press, 2005: 205.
[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al. Óptica adaptativa computacional para imágenes biológicas tridimensionales in vivo [J]. -3795.
[3] Booth MJ, Neil MAA, Giuskaitis R, et al. Corrección de aberración adaptativa en microscopía confocal [J]. Actas de la Academia Nacional de Ciencias, 2002, 99 :5788-5792.
[4] Carretera Goldman, Carretera Spectre. Manual de laboratorio de imágenes de células vivas [J]. Prensa del laboratorio Jinquangang, 2005.
[5] Monver, Scaron, Kalvez, et al. Deconvolución adaptativa de imágenes para imágenes biológicas profundas tridimensionales [J].
[6], Guo, Qu. Volumen inverso de fluorescencia tridimensional.