1. La cromatografía líquido-sólido utiliza adsorbentes sólidos. El principio de separación de componentes separados en la columna cromatográfica se basa en las diferentes fuerzas de adsorción de los componentes relativos fijos. El proceso de separación es un proceso de equilibrio de adsorción-desorción. Los adsorbentes más utilizados son el gel de sílice o la alúmina, con un tamaño de partícula de 5 ~ 10 μm. Es adecuado para separar componentes con un peso molecular de 200 ~ 1000. La mayoría de ellos se utilizan para compuestos no iónicos y los compuestos iónicos. fácil de seguir. A menudo se utiliza para separar isómeros.
2. La cromatografía líquido-líquido utiliza una fase estacionaria, que se forma recubriendo una sustancia líquida específica sobre la superficie del soporte o uniéndola químicamente a la superficie del soporte. El principio de separación es separar los componentes a separar en función de sus diferentes solubilidades en la fase móvil y la fase estacionaria. El proceso de separación es un proceso de equilibrio de distribución.
La fijación del recubrimiento tiene buena inercia; la fase móvil debe saturarse con la fase estacionaria de antemano para reducir la pérdida de la fase estacionaria de la superficie del soporte y las diferencias frecuentes en diferentes lotes de fases móviles; provocar cambios de falla en la columna cromatográfica; además, la fase estacionaria en la fase móvil también complica la separación y recolección de muestras; Las fases estacionarias recubiertas rara vez se utilizan hoy en día porque la pérdida de solución estacionaria es inevitable. Actualmente se utilizan ampliamente fases estacionarias unidas químicamente, como C18, C8, columnas amino, columnas ciano, columnas fenilo, etc.
Según las diferentes polaridades de la fase estacionaria y la fase móvil, la cromatografía líquido-líquido se puede dividir en cromatografía de fase normal (NPC) y cromatografía de fase reversa (RPC).
La cromatografía en fase normal utiliza fases estacionarias polares (como polietilenglicol, fases unidas con amino y nitrilo) y la fase móvil son disolventes hidrófobos relativamente no polares (alcanos como n-hexano y ciclohexano), etanol, A menudo se añaden alcohol isopropílico, tetrahidrofurano y cloroformo para ajustar el tiempo de retención de los componentes. Comúnmente utilizado para separar compuestos moderadamente y altamente polares (como fenoles, aminas, carbonilos y aminoácidos).
Normalmente, en la cromatografía de fase reversa se utilizan fases estacionarias no polares (como C18, C8). La fase móvil es agua o tampón y a menudo se añaden disolventes orgánicos solubles en agua como metanol, acetonitrilo, alcohol isopropílico, acetona y tetrahidrofurano para ajustar el tiempo de retención. Es adecuado para la separación de compuestos no polares y débilmente polares. RPC es el método más utilizado en la cromatografía líquida moderna. Según las estadísticas, representa aproximadamente el 80% de todas las aplicaciones de HPLC.
Con el rápido desarrollo del empaque de columnas, el ámbito de aplicación de la cromatografía de fase reversa se ha ampliado gradualmente y se ha aplicado al análisis de algunas muestras inorgánicas o muestras fácilmente disociadas. Durante el proceso de análisis, para controlar la disociación de la muestra, se suelen utilizar tampones para controlar el valor del pH de la fase móvil. Pero cabe señalar que el valor de pH utilizado por C18 y C8 suele ser de 2,5 a 7,5 (2 a 8). Un valor de pH demasiado alto disolverá el gel de sílice y un valor de pH demasiado bajo hará que los grupos alquilo unidos se caigan. Se informa que la nueva columna comercial puede funcionar en el rango de pH de 1,5 a 10.
Tabla comparativa entre cromatografía en fase normal y cromatografía en fase reversa
Cromatografía en fase normal y cromatografía en fase reversa
La polaridad de la fase estacionaria es alta~media~baja .
La polaridad de la fase móvil es baja~media~alta.
El orden de elución de los componentes es que los componentes menos polares se eluyen primero y los componentes más polares se eluyen primero.
Como se puede ver en la tabla anterior, cuando la polaridad es media, no existe un límite obvio entre la cromatografía de fase normal y la cromatografía de fase reversa (como la fase estacionaria con enlaces amino).
3. La fase estacionaria de la cromatografía de intercambio iónico es la resina de intercambio iónico, que suele ser un esqueleto polimérico formado por la reticulación de estireno y divinilo, con grupos carboxilo y ácido sulfónico unidos a los anillos aromáticos terminales. la superficie (llamada resina de intercambio catiónico) o grupo amino cuaternario (resina de intercambio aniónico). El principio de separación de componentes en una columna cromatográfica es que los iones ionizables de la resina sufren un intercambio reversible con iones con la misma carga en la fase móvil y con iones del componente que se está midiendo, y se separan en función de la atracción de carga diferente de cada ion y el grupo de intercambio iónico.
Los tampones se utilizan habitualmente como fases móviles en cromatografía de intercambio iónico. El tiempo de retención de los componentes separados en una columna de intercambio iónico no sólo está relacionado con la interacción entre los iones de los componentes y los grupos de intercambio iónico de la resina, sino que también se ve afectado por el valor del pH y la fuerza iónica de la fase móvil.
El pH puede cambiar el grado de disociación de un compuesto, lo que a su vez afecta su interacción con la fase estacionaria. Cuando la concentración de sal de la fase móvil es alta, la fuerza iónica es alta, lo que no favorece la disociación de la muestra, lo que hace que la muestra fluya rápidamente.
La cromatografía de intercambio iónico se utiliza principalmente para analizar ácidos orgánicos, aminoácidos, péptidos y ácidos nucleicos.
4. La cromatografía de pares iónicos, también conocida como cromatografía de iones acoplados, es una rama de la cromatografía líquido-líquido. Se basa en la formación de compuestos de pares iónicos neutros entre los iones del componente medido y los iones del reactivo de par iónico, que aumentan la solubilidad en la fase estacionaria no polar, mejorando así el efecto de separación. Se utiliza principalmente para analizar sustancias ácidas y alcalinas con alta fuerza iónica.
Los reactivos de pares iónicos comúnmente utilizados para analizar sustancias alcalinas son los alquilsulfonatos, como el pentanosulfonato de sodio, el octanosulfonato de sodio, etc. Además, el ácido perclórico y el ácido trifluoroacético también pueden formar pares iónicos fuertes con diversas muestras alcalinas.
Las sales de tetrabutilamonio de amonio cuaternario, como el bromuro de tetrabutilamonio y el fosfato de tetrabutilamonio, se utilizan habitualmente para analizar sustancias ácidas.
Las columnas ODS (es decir, C18) se utilizan habitualmente en cromatografía de pares iónicos. La fase móvil es metanol-agua o acetonitrilo-agua, y se añade al agua un reactivo de par iónico de 3~10 mmol/L para separarlo dentro de un cierto rango de pH. El tiempo de retención del componente medido está relacionado con la naturaleza y concentración del par iónico, la composición de la fase móvil, su valor de pH y su fuerza iónica.
5. La fase estacionaria de la cromatografía de exclusión es un empaque poroso con un tamaño de poro determinado, y la fase móvil es un disolvente que puede disolver la muestra. Los compuestos con un peso molecular pequeño pueden entrar en los poros y tienen un tiempo de residencia prolongado; los compuestos con un peso molecular grande no pueden entrar en los poros y salir directamente con la fase móvil. Utiliza la diferencia en la capacidad repelente de los tamices moleculares para componentes de diferentes pesos moleculares para completar la separación. A menudo se utiliza para separar compuestos macromoleculares, como extractos de tejidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.
Principios básicos de la cromatografía
Según las diferencias en las propiedades químicas y físicas de cada componente de la mezcla de muestra, cada componente se distribuye en dos fases inmiscibles en distintos grados. Cuando las dos fases se mueven entre sí, los componentes se redistribuyen repetidamente entre las dos fases, lo que da como resultado la separación de la mezcla.
De las dos fases, la fase estacionaria es fija;
Clasificación:
Según fase móvil - fase gaseosa como fase móvil - cromatografía de gases - fase estacionaria como cromatografía de gases en fase líquida.
Cromatografía gas-sólido con sólido como fase estacionaria
-Cromatografía líquida con líquido como fase móvil-Cromatografía líquida con líquido como fase estacionaria.
Cromatografía líquido-sólido con sólido como fase estacionaria
Cuando la fase móvil es un líquido que opera cerca de su temperatura y presión críticas - cromatografía supercrítica
Según el método de fijación de la fase estacionaria
-Fase estacionaria en cromatografía en columna cilíndrica
-Fase estacionaria recubierta sobre placa de vidrio o metal-Cromatografía de película fina (cromatografía en placa plana)
p >-Fase estacionaria líquida recubierta sobre papel-Cromatografía en papel (cromatografía en placa)
Dependiendo del mecanismo de separación
-Cromatografía de distribución-los coeficientes de partición de los componentes de la muestra son diferentes .
—Cromatografía de adsorción—los componentes de la muestra tienen diferentes fuerzas de adsorción en la superficie de la fase estacionaria.
-Cromatografía de exclusión por tamaño-utiliza fases estacionarias de diferentes tamaños de poro para separar los componentes de la muestra en función del tamaño molecular.
-Cromatografía de intercambio iónico-Los diferentes iones tienen diferentes fuerzas entre cargas opuestas de la fase estacionaria.
Según polaridad
-polaridad de fase móvil>polaridad de fase estacionaria-cromatografía de fase inversa
-polaridad de fase móvil