El rango lineal y la sensibilidad de cada ensayo se evaluaron mediante el análisis de diluciones en serie de ADN extraído de una única cepa de cada n patógeno objetivo. Las cepas de patógenos utilizadas incluyeron: Paecilomyces tomate DC3000, Paecilomyces fastidiosa Temecula y la cepa modelo de WSMV. Dos personas diferentes prepararon y probaron diluciones seriadas de ADN de 10 veces en días diferentes. Cada analista preparó cuatro curvas estándar que contenían cada concentración y las analizó mediante PCR en tiempo real. La repetibilidad se determinó calculando el %CV (CV = desviación estándar/media) de las ocho réplicas de una única concentración. La precisión intermedia se determinó comparando el valor medio de Ct para cada réplica individual.
El rango lineal y la sensibilidad de cada ensayo se diluyeron analizando el ADN extraído de una única cepa de cada patógeno objetivo. Los patógenos incluyen: cepas de tomate P.S. DC3000, X. fastidiosa y WSMV. Dos personas diferentes prepararon y probaron diluciones seriadas de ADN diez veces mayores en días diferentes. Prepare cuatro gradientes de concentración de curva estándar para cada sistema analítico y pruébelos para PCR en tiempo real. Repita las concentraciones individuales calculando la repetibilidad de las ocho mediciones de CV (CV = desviación estándar/media). La precisión de los valores intermedios se determinó comparando los valores CT promedio de las réplicas entre sí.
Límite de detección reproducible (LOD)
Límite de detección reproducible (LOD)
Para cada análisis, se permite la detección de 8 de 8 réplicas El más bajo La concentración de la curva estándar (umbral de ciclo inferior a 40 y valores de Ct con una diferencia de 2,0 Ct entre sí) se consideró el límite de reproducibilidad del ensayo (LOD). Para confirmar esto, dos personas prepararon cada uno 20 réplicas de concentraciones de LOD y las probaron mediante PCR en tiempo real en placas separadas, lo que dio como resultado un total de 40 réplicas. La repetibilidad y la precisión intermedia se determinaron como se describió anteriormente.
Para cada método, se consideró como límite de reproducibilidad la concentración más baja de la curva estándar, el umbral permitido para 8 repeticiones de 8 a 40 ciclos y los valores de CT dentro de dos rangos entre sí. detección (LOD). CON Group, Inc., dos personas prepararon cada una 20 concentraciones de LOD replicadas y probaron su PCR en tiempo real para producir un máximo de 40 copias de la placa dividida. La repetibilidad y la consistencia se determinaron con la precisión descrita anteriormente.