Dado que es un pequeño "tubo de ensayo", debería ser expresión procariótica. Generalmente, el promotor lacZ se usa para inducir la expresión, así que seguiré este paso. p>
1, Pruebe la solubilidad de la proteína expresada: inocule 5 ml o 10 ml de bacterias agitadas con cepas frescas, primero agite a 37 °C, induzca durante 3 h después de 3 horas (es mejor tener referencia bibliográfica para esta temperatura). y tiempo), recolectar las células y lavar con PBS durante 2 Luego, resuspender en 1 ml de PBS, romper las bacterias (ultrasónico, o agregar lisozima, o un kit de prueba, etc.), centrifugar a 12,000 rpm durante 20 min, y recoger el sobrenadante y el precipitado respectivamente. Resuspender el sedimento en 1 ml de PBS, agregar el tampón de carga SDS-PAGE a 1X, hervir durante 5 minutos, agregar la carga al sobrenadante y hervir al mismo tiempo. Tomar una cantidad adecuada de sobrenadante y sedimento y ejecutar SDS-page para. ver si la proteína está en la distribución del sobrenadante y del sedimento, generalmente elegir la que tenga más distribución para la purificación posterior si la cantidad en el sobrenadante es pequeña, pero es suficiente, se prefiere la proteína en el sobrenadante de purificación porque es soluble. , y la proteína en el precipitado es el cuerpo de inclusión.
2. Optimice las condiciones de expresión, lo que requiere múltiples conjuntos de tiempos de control para verificar la temperatura de expresión adecuada (este paso a menudo es necesario). debe hacerse junto con 1. A veces los cuerpos de inclusión a 37°C se encuentran a temperaturas más bajas y pueden parecer solubles), tiempo de expansión y tiempo de inducción.
Eso es básicamente todo. Si tienes alguna pregunta, no dudes en continuar la discusión. ¡Deseo que el experimento vaya bien!