Investigación sobre la fermentación de celulosa de paja de arroz en etanol combustible
Resumen
mi país es rico en recursos de paja de arroz, con una producción anual producción de más de 300 millones de toneladas. ¿Es correcto utilizar paja de arroz para producir etanol combustible?
China tiene un enorme potencial y amplias perspectivas de aplicación en cuestiones energéticas, ahorro de granos y protección ambiental en el futuro. El componente principal de la paja de arroz es la celulosa. El factor limitante más importante en la utilización de la celulosa es la conversión de la celulosa en celulosa fermentable.
Hay dos formas principales de resolver este problema: (l) Mejorar la economía de la producción de celulasa, que implica principalmente un alto contenido de celulasa.
Adquirir tecnología de producción de celulasa y mejorar su eficiencia de síntesis para reducir los costos unitarios de producción de celulasa; (2) mencionado
La eficiencia de utilización de la proteasa implica principalmente el proceso de catálisis de hidrólisis de celulasa para reducir el costo de producción. por unidad de azúcar reductor fermentable.
Este estudio comenzó con el cultivo de cepas bacterianas, estudió las características de producción de enzimas y utilizó una estrategia de superficie de respuesta para optimizar el medio de fermentación.
Introdujimos el proceso de fermentación discontinua en tanque de fermentación SL para producir celulasa de alta actividad. Aislamiento y purificación de celulasas. Cultivar una generación de personas
Bacterias de ingeniería del disacárido Saccharomyces cerevisiae; estudió la fermentación inmovilizada de células de bacterias de ingeniería Saccharomyces cerevisiae, utilizando un método de fermentación de dos etapas
Enzima sinérgica del sistema de desastre del biorreactor Arroz en descomposición paja para producir etanol combustible. Los principales resultados son los siguientes
1. Se seleccionó una cepa con alta producción de celulasa (Penicillium YT01). Después los protoplastos fueron inducidos por luz ultravioleta.
Las cepas mutantes YT02 e YT02 utilizaron paja de arroz como fuente de carbono, polvo de torta de soja y sulfato de dinero como fuente de nitrógeno. A 29 ℃, el P
fermentó durante 12 Oh. , y la actividad celulasa alcanzó el nivel más alto. La actividad enzimática del papel de filtro (FPA) y la actividad enzimática CMC (CMcas) se fermentaron en matraces agitados.
Las actividades de la glucosa oxidasa (CB) alcanzaron 3,86 UI/mL, 207,41 UI/mL y 1,4 iu/mL respectivamente.
2. La composición del medio de fermentación optimizada por el método de superficie de respuesta es: paja de arroz 41,95 L,
es 24,83 g/L, el número de piel es 22,16 ba, es H4)2504 y KHZpO4 es 4 g/L, MgSO porque 0,sg/L. Se originó a partir de
Después de 120 h de fermentación en el medio optimizado, la actividad enzimática del papel de filtro, la actividad enzimática cMc y la actividad enzimática de β-glucosa alcanzaron el nivel máximo. más alto respectivamente.
Unidades internacionales/ml, 357,41 UI/ml y 3.704 UI/ml Muy superior al nivel de actividad celulasa antes de la optimización.
3. Se estudiaron los efectos de la temperatura, el valor del pH y el oxígeno disuelto sobre el crecimiento celular y la producción de enzimas en el fermentador SL.
Las condiciones del proceso de fermentación son: la temperatura de fermentación es ℃, 0-32 h, el oxígeno disuelto es 70; agregar H a 1 provocará la fermentación.
29 oc, oxígeno disuelto 50, valor de pH inicial del caldo de fermentación 6,0, actividad enzimática del papel de filtro, actividad enzimática CMC y P-glucosa después de la fermentación h.
Las actividades enzimáticas alcanzaron 11,13 UI/mL, 465,24 UI/mL y 4,08 UI/mL respectivamente, todas ellas superiores a las de la fermentación en matraz agitado.
El proceso de cinética de fermentación mostró que el crecimiento de la cepa mutante YT02 estaba parcialmente relacionado con el componente celulasa.
4. Se aislaron y purificaron dos endonucleasas utilizando deheadasa A-25 y sephadexG-75.
(CMCasa) y una enzima p-glucosa, el factor de purificación de CMCasa es 13,48 y la tasa de recuperación es 10,54.
El factor de purificación de la glicosidasa es 18,62, y la tasa de recuperación es 8,62. SDS-PAGE obtuvo una única banda de molécula de proteína.
I
, cadáver de la puerta _Xin sandwich 3bu'' de Shanghai,...
Los contenidos son 73 kDa, 43 kDa y 57,8 kDa respectivamente, a través del N -terminal Secuenciación y espectrometría de masas.
5. La cepa receptora de esta cepa de ingeniería es Saccharomyces cerevisiae NAN-27, que tiene un excelente rendimiento de producción de etanol. Uso
PYMIKP es un buen vector de integración de copias múltiples que puede integrar el gen BGLI del metabolismo de la celobiosa en Saccharomyces cerevisiae.
Físicamente. Por lo tanto, se estableció una vía metabólica estable de la celobiosa en una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae, expandiendo así la producción de alcohol.
El rango de utilización de la celulosa reduce el efecto inhibidor de la celobiosa sobre la hidrólisis de la celulasa. Se utilizó gel de alginato de calcio para la inclusión y fijación.
En comparación con las células libres, las células inmovilizadas de la cepa modificada con celobiosa Saccharomyces cerevisiae tienen un tiempo de fermentación más corto y una mayor producción de etanol.
Puede utilizar eficazmente el hidrolizado de paja de arroz para la fermentación alcohólica.
6. Se estudió el sustrato, la temperatura de hidrólisis enzimática, el pH de hidrólisis enzimática, la concentración del sustrato y las propiedades de la celulasa durante la hidrólisis enzimática de la paja de arroz.
Y se estudiaron otros factores clave. Debido a la baja actividad de la celulosa dicelulosa en el sistema de celulasa YT02 (el equipo CB/F es
La tasa de conversión de etanol de la celulosa de paja de arroz pretratada con ácido y álcali diluidos es solo 65438±08. Uso de celobiosa metabolizante
El efecto inhibidor de la celobiosa sobre la hidrólisis enzimática se puede aliviar parcialmente mediante la fermentación celular libre de las bacterias madre de ingeniería, y la tasa de celulosa de paja de arroz se puede aumentar a
20. , se inmovilizaron trabajadores de Saccharomyces cerevisiae que metabolizan la celobiosa en gel de alginato de calcio para fermentar etanol y celulosa de paja de arroz con una tasa de conversión de hasta el 26%. Ayuda a obtener una comprensión profunda de la fibra. -mecanismo de degradación
7. La hidrólisis enzimática y la inmovilización de las materias primas de fibra están vinculadas orgánicamente a los efectos de las bacterias de ingeniería Saccharomyces cerevisiae /p>
El nuevo biorreactor en serie de dos etapas puede eliminar eficazmente la fibra. 2 bajo el efecto sinérgico del sistema reactor.
La inhibición por retroalimentación de la celulasa por la glucosa promueve la hidrólisis enzimática y la fermentación de la paja de arroz.
Hasta 25,5 L. , la tasa de conversión de celulosa a etanol alcanza 43,0 (la tasa de conversión teórica de celulosa a etanol es 56,438 0
1,65 veces la de SSF, la eficiencia de producción es de 0,64 Lh. Alimentación por lotes
La tecnología de fermentación enzimática puede aumentar la concentración final del sustrato de fibra a 250 Lh y la concentración final del producto de etanol a 66,51, dejando L,
Mejora la tasa de utilización de la celulasa y la eficiencia de producción de etanol. y reduce el coste de producción de etanol.
El reactor tiene alta eficiencia, las células inmovilizadas se pueden reutilizar y es fácil de automatizar.
Palabras clave: celulasa, paja de arroz. , Saccharomyces cerevisiae, etanol combustible, biorreactor en serie
Contenido
Resumen... ...................... ................................................. ....... ..
Resumen................................................ ....................................IH
El primer capítulo es una literatura revisar.
Recursos de paja de arroz y sus métodos de degradación................................ ....... ....
1.1 Composición y estructura de la paja...,...................... ....... ..l
1.2 Pretratamiento de la paja........................ ............. .....3
1.2.1 Métodos físicos para pretratar la paja de arroz... ......................... ....3
1.2.2 Pretratamiento químico de la paja de arroz................. .......... ...3
1.2.3 Pretratamiento biológico de la paja de arroz.................. ... ................IV
1.3 Modelo de degradación de la celulosa de paja de arroz................. ........................4
1.3 1 Paja de arroz hidrolizada con ácido.... ........ .................................5
1.3.2 Hidrólisis enzimática ................................................ ....de paja Medio...5
2 Propiedades y usos de la celulasa........................ .. ...........6
2.1 Sistema multienzimático........................ .. ..................Celulasa...6
2.2 Estructura molecular de la celulasa ................. ...................................7
2.3 Mecanismo de acción de la celulasa. ................................................. ............. 9
2.4 Peso molecular de la celulasa................................. ........ .....10
2.5 Condiciones óptimas de reacción y estabilidad de la celulasa....... .................11
2.6 Aplicación de celulasa... ......................................... ........................ .h
3 Producción de celulasa................ ................. .................12
3.1 Mejoramiento de células productoras de celulasa bacterias................ .................................12
3.2 Producción de celulasa.................................................. .......................... ..14
4 Bioconversión de paja de arroz en etanol combustible...... ......................... .........15
4.1 Ventajas y uso actual del etanol combustible. ...........
.................15
4.2 Método para bioconvertir etanol combustible a partir de celulosa de paja de arroz............. . ............16
4.2.1 Hidrólisis y fermentación paso a paso para producir etanol combustible............. .. ......................16
4.2.2 Producción de etanol combustible ............ .. ...........................por sacarificación y fermentación simultáneas...16
I
4.2.3 Producción de etanol combustible................................mediante fermentación de células inmovilizadas...17
4.3 El Proyecto Youliang Liquor Yeast Pathway se aplica a la producción de etanol combustible...................... ......17.
5. El propósito, significado y contenido principal de este estudio........................ ............. 19
5.1 El propósito y la importancia de este estudio................. ................19
5.2 Las ideas y rutas técnicas de esta investigación .................................... ..........20
5.3 El contenido principal de este estudio es........................ ........... ............21
Capítulo 2: Crianza de bacterias productoras de celulasa e investigación sobre condiciones productoras de enzimas... .......... .............23
1Materiales y métodos................ ........ .................................23
1.1 Materiales................................................ ................... ............23
1.1.1 Reactivos y preparación de la solución.... .................... ..................
1.1.2 Cepas y Fuentes de aislamiento de cepas ......................................... .........24
1.1.3 Medio................................ ................... .................24
1.1.4 Principales instrumentos y equipos... .................... .................25
1.2 Método. ..... ................................................. .................... .......25
Pretratamiento de la paja de arroz........ ............., ...,............25
1.2.2 Aislamiento y purificación de bacterias productoras de celulasas. ........... ............25
1.2.3 Identificación preliminar de bacterias productoras de celulasa...... .. ...................
............25
1.2.4 Mutación........................ .. ..... Utilizando mutagénesis ultravioleta de protoplastos bacterianos productores de celulasa...25
Un método de cultivo de fermentación líquida de 1.2.5YTOZ para la producción de celulasa.... .......... ...26
1.2.6 Hidrólisis enzimática................. .................... ....de diferentes pajas de arroz pretratadas...27
1.2.7 Métodos analíticos... ...................... .......................................... .....27
2 Resultados y análisis................................. ................ ........29
2.1 Contenido de varios componentes en diferentes pajas de arroz pretratadas.... .................29
2.2 Aislamiento y cribado de bacterias productoras de celulasa ................................29<. /p>
2.3 Producción de celulosa Identificación de la cepa YT01........................31
2.4.... ....................Mutagénesis ultravioleta de protoplastos de la cepa productora de celulasa YT01...31
2.5 Efectos de la composición del medio de fermentación líquido y la fermentación condiciones sobre la producción de celulasa por YT02....32
2.5 .1 Efectos de diferentes fuentes de carbono sobre la producción de enzimas por YT02........ ............................ ..32
2.5.2 Efectos de diferentes pretratamientos de paja de arroz sobre la enzima producción por YT02............. ....33
2.5.3 Efectos de diferentes fuentes de nitrógeno en la producción de celulasa por YT02....... ............... .........34
二
2.5.4 Efecto de la adición de celulosa microcristalina sobre la celulasa producción por YT02....... .................35
2.5.5 Efectos de diferentes sales inorgánicas sobre la producción de celulasa por YT01. .. ................35
2.5.6 Efecto del pH inicial sobre la producción de celulasa por YT01.... ........... .................36
2.5.7 Efecto de la carga líquida en la producción de celulosa por YT02 Efectos de las enzimas...... .................37
2.5 8 Efecto de la velocidad de rotación en la producción de celulasa por YT02............. ..........37
2.5.9 Efecto de la temperatura del cultivo sobre la producción de celulasa por YT02................. .... .....38
2.5.10 Efecto del tamaño del inóculo sobre la producción de celulasa por YT02.................... ............39
2.5.n Efecto del tiempo de cultivo en la producción de enzimas por YT02............. .... .
............40
2.6 Investigación sobre las propiedades enzimáticas de la celulasa............. ......... ....41
2.6.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de los componentes de la celulasa ........................ ................................................. ........................ ………………………….
2.6. Efecto de la ZPH sobre la actividad de los componentes de la celulasa....................41
2.7 Hidrólisis enzimática de diferentes pajas de arroz pretratadas por celulasa... .......... ............42
3Conclusión y discusión................ ........................................4: L.
3.1 Acerca de las cepas de celulasa de alta producción seleccionadas...................... ......4:3
3.2 Transformación de bacterias productoras de celulasa........................ ................. ......
3.3 Condiciones de producción de enzimas y propiedades enzimáticas de Penicillium YT02... ............44
Capítulo 3 Optimización del medio de fermentación productor de celulasa YT02 .................45
1Materiales y métodos............ .. ..........................45
1.1 Materiales....... ................................................. ................. .45
1.1.1 Reactivos...................... .......................... ......45
1.1.2 Cepa de prueba.... .................... .............45
1.1.3 Medio..... ................... ................45
1.1.4 Principales instrumentos y equipos... ......... ................................46
1.2 Método .. ................................................. ............. ............4.
1.2.1 Diseño experimental.......... ............. ............46
1.2.2 Métodos de cultivo.......... ..................46
1.2.3 Método de análisis...... . ................................................. ... ..46
2 Resultados y análisis................................ ....... ......47
2.1 Principales factores que influyen en el medio de cultivo de fermentación analizado mediante experimento factorial parcial....... .. ......47
2.2 El experimento de ascenso más pronunciado está cerca del punto óptimo del medio de fermentación............. ........ ....50
111
2.3 Diseño de combinación de centros para optimizar la composición del medio de fermentación YT02....... ........... ......51
2.4 Resultados de la medición de cambios en el pH, azúcares reductores residuales y celulasa durante la fermentación ................59
3Conclusión y Discusión........................ ............., .... ........., 61
Capítulo 4 YT02 producción de fermentación por lotes Investigación sobre celulasa................63
Materiales y método.................
................................................63
.1Material................................... ..... ............63
1.1 Reactivos........................ .. ........................................63
. 1.2 Deformación. ................................................. ... .........63
1.3 Moderado........................ ...... ............................
1.4 Instrumento principal.. ......... ................................................. ...... ......64
Método........................
. 1 para cultivo de semillas de fermentación por lotes....
. …64
. …64
1.2.2 Efecto de la fermentación discontinua a temperatura constante sobre la producción de celulasa por YT02........................ ... ...64
1.2.3 Efecto de la fermentación discontinua a temperatura variable sobre la producción de celulasa por YT02................. .......64
1.2.4 Efecto del oxígeno disuelto en la producción de celulasa mediante fermentación discontinua YT02............. ............64
1.2.5 Efecto del oxígeno disuelto en la producción de celulasa mediante fermentación discontinua de YT02... ................65
1.2.6 Método de análisis ............. ................................65
2 resultados y análisis.................................... ....... ...........65
2.1 Efecto de la temperatura de fermentación sobre el rendimiento de celulasa en los resultados de YT02............. ............65
2.2 Efecto de la fermentación a temperatura variable sobre los resultados de producción de celulasa por YT02............ .... .........68
2.3 Efecto del oxígeno disuelto en los resultados de producción de celulasa por YT02............. ......... ....69
2.4 Efecto de la fermentación por etapas con oxígeno disuelto en lotes sobre los resultados de la producción de celulasa por YT02 .................72
3Conclusión y discusión...................................................... ..............73
Capítulo 5: Aislamiento, purificación y propiedades enzimáticas de la celulasa producida por YT02......
Ding 'Ding' y U(b
p>(btding'ding'
Materiales y métodos...
. 1 Materiales...
.1.1 Materiales de prueba.
1.2 Reactivo principal.
..........76
..........76
3 Soluciones madre y buffers comunes. ...... .................................
1.1.4 Principal instrumento..... ............................................ .................... ..78
1.2 Método................. ................. ..................78
1.2.1 Método de determinación de la concentración de proteínas.. ....................................78
1.2.Aislamiento y purificación. de celulasa................................................ ...79
1.2.3 Purificar la celulasa mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y determinar el peso molecular relativo de la celulasa......83
1.2.4 Secuenciación N-terminal de proteínas enzimáticas.... ............................ ............85
1.2. 5 Análisis por espectrometría de masas de proteínas enzimáticas....... ............86
2 Resultados y análisis..... ........................................................ ......................... ..87
2.1Resultados de la cromatografía de intercambio aniónico DEAE-SephadexA-25....... ................. ..
2.1.1 La relación entre tubulina y la concentración de NaCI en el tampón de elución es... 87
2.1.2 Detección de la actividad proteica de la enzima tubular recogida por cromatografía........................ ...........
2.25 es el resultado de la cromatografía de filtración en gel de tamiz molecular hadexG-75............. .............88.
2.2.1 Cromatografía de filtración en gel de tamiz molecular SephadexG-75 para separar proteínas enzimáticas............. ...........
2.2.2 Determinación de la actividad celulasa mediante cromatografía de filtración en gel de tamiz molecular..........88
2.3 Purificación de celulasa en diferentes purificaciones pasos....................89
2.4Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE..... ... ...............90
2.4.1Resultados de la tinción con plata SDS-PAGE .................. ................
2 . 4 . 2 Determinación de fibra mediante electroforesis en gel SDS-PAGE Los resultados del peso molecular de la enzima.... ....................91
Los resultados de la secuenciación N-terminal de la proteína enzima 2.5.. ........ ........................................91
2.6 Huevo Enzimático
Resultados de la espectrometría de masas de White................................................. 93
3Conclusión y discusión........................ ............94
Capítulo 6 Construcción de la ruta metabólica de la celobiosa en Saccharomyces cerevisiae e investigación sobre la inmovilización celular ................96
Materiales y métodos..... ................... ................................. ................................. .............
1Materiales................................ ..................... ............96
1.1 Cepas y plásmidos ........................ ......................................... ......96
1.2 ........................................ ...... .Una enzima y reactivo para la clonación molecular...96
1.3 Preparación de hidrolizado de paja de arroz............. ............ ......97
2 métodos...... ................................. ................................................. .......98
2.1 Método de construcción del plásmido recombinante pYMIKP que contiene el gen de la celobiasa (y la maldición 1).
2.2 Método de construcción de la ruta metabólica de la celobiosa en Saccharomyces cerevisiae .................................99
1.2.3 Método de inmovilización de células genéticamente modificadas de Saccharomyces cerevisiae ............................ ..... .101
1.2.4 Método de fermentación de células de levadura inmovilizadas........................ ........ .....102
1.2.5 Método de análisis................. ................... ..............102
2 Resultados y análisis ............. .......................................... .......103
2.1 Resultados de expresión y construcción de cepas recombinantes con genes regulados............. .............103.
2.1.1 Genes diana y obtenidos ............. ............103.
2.1.2 Construcción de plásmido recombinante que contiene el gen diana..... .................103
2.1.3 Obtener la transformación del cuerpo NAN-27 de Saccharomyces cerevisiae,. ....................104.
2.1.4...... ........... .1 () 4.
2.2 Efectos de diferentes condiciones de inmovilización sobre la inmovilización de células NAN-28...... .......105.
2.2 .1 Resultados de la determinación de diferentes disolventes en la delubricación de fibras convertidas en células inmovilizadas...................................... ................................................. ............. ................................................. .. ................................65438 15
2.2.2 Efecto de diferentes concentraciones del alginato de sodio sobre las propiedades del gel de las células inmovilizadas .................L () 5
2.2.3 Efecto de la cantidad de inclusión de levadura en la resultados de la conversión de celobiosa por células inmovilizadas.. .............! 06
2.3 Resultados experimentales de la fermentación discontinua de células inmovilizadas y células libres........................ ..l () 6
2.4 Resultados de fermentaciones por lotes repetidas de células inmovilizadas........................ .........107
3Conclusión y discusión................................ ................ .................108
3.1 La vía del metabolismo de la celobiosa de la levadura Youliangjiu Build................. ...................108
3.2 Proyecto Fijación de células de Saccharomyces cerevisiae................. ........110
Capítulo 7 Investigación sobre la producción de etanol combustible mediante biorreactores en serie.......112
Materiales
y métodos................................................ .......112
lMateriales........................ .................. 112.
1.1 Reactivos........................ ................. ................................................. 112.
1.2 Cepas.................................... ..................112
1.3 Principales instrumentos y equipos............. ..... .............112
Método............. ................. ................................................. ....112.
2.1 Pretratamiento del polvo de paja de arroz........................ ....... ...........112
2.2 Preparación de celulasa............ ................. .................113
2.3 Sacarificación enzimática del polvo de paja de arroz... ................ ...................................113
2.4 Bioconversión de paja de arroz en combustible etanol................................................ ..114
2.5 Método de determinación................................................ .......... ...115
Sistema de Reconocimiento Visual
2 Resultados y Análisis..... .................... ................................................. .116
2.1 Efectos de diferentes métodos de pretratamiento sobre el efecto de sacarificación de la paja de arroz.................116
2.2 Efectos de diferentes temperaturas sobre el efecto de sacarificación de la paja de arroz....116
2.3 Efectos de diferentes valores de pH sobre el efecto de sacarificación de la paja de arroz en polvo.... ......... ..117.
2.4 Efectos de diferentes dosis de enzimas sobre el efecto de sacarificación del polvo de paja de arroz............. ... .118.
2.5 Efectos de diferentes concentraciones de sustrato sobre el efecto de sacarificación del polvo de paja de arroz............. .....118
2.6 Resultados de la paja SSF........................ ....119.
2.7 Conversión de paja de arroz en etanol en serie reactores...................... ......120
2.7.1 Resultados de la producción de etanol combustible mediante fermentación de NAN inmovilizada -28 células................... ...120.
2.7.2 Resultados de estabilidad de biorreactores en serie..... .......
.................121.
2.7.3 ............. ....... ..122, resultados de la fermentación enzimática colaborativa por lotes alimentados para producir etanol combustible.
3Conclusión y discusión................................................ .. ...........122
3.1 Producción de etanol mediante biorreactor en serie de dos etapas............. ......... .........122
3.2 Proceso de fermentación enzimática colaborativa Fed-batch............. ............ .123
3.3 Aprovechamiento total de los recursos de paja de arroz....................... ........123
No Capítulo 8 Conclusión................................ ........... .........124
Referencias principales..................... .... ..................126.
Lista de abreviaturas en inglés y símbolos principales............. ........................................146
Estas características e innovaciones de la investigación................................. ....... .147
Artículos y resultados académicos publicados y propuestos........................ .......... ...148
Debido a ................................. ........ ....................149
Acerca del autor ................. ................................................. ... ......150
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