Coexpresión de los genes de carbonil reductasa y glucosa deshidrogenasa mediante la transformación de células de Escherichia coli
Síntesis de células transformadas de E. coli que expresan carbonil reductasa y glucosa deshidrogenasa
Éster etílico del ácido (S)-4-cloro-3-hidroxibutírico óptico puro
Resumen Reducción asimétrica de 4 -cloro-3-etilo
Se estudió la conversión de oxobutirato (COBE) a (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de (S)-etilo
((S)-CHBE). Como catalizadores se utilizaron células de E. coli que expresan el gen de la carbonil reductasa (S1) de Candida magnolia y el gen de la glucosa deshidrogenasa (GDH) de Bacillus megaterium. En el sistema bifásico orgánico-disolvente-agua, el (S)-CHBE formado en la fase orgánica ascendió a 2,58 M (430 g/l) con un rendimiento molar del 85 %. Las células transformantes de E. coli que coproducen S1 y GDH acumularon 1,25 M (208 g/l) (S)-CHBE en un sistema monofásico acuoso mediante alimentación continua de COBE, que es inestable en solución acuosa. En este caso, la conversión calculada de NADP+ (la forma oxidada del fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina) en CHBE es de 21.600 mol/mol. En ambos sistemas, la pureza óptica del (S)-CHBE formado fue de un exceso enantiomérico del 100%. El sistema acuoso utilizado para reacciones de reducción que involucran células HB101 de E. coli que portan plásmidos que contienen los genes S1 y GDH como catalizadores es simple. Además, este sistema no requiere la adición de GDH o disolventes orgánicos disponibles comercialmente. Por tanto, este sistema es muy ventajoso para la síntesis práctica de (S)-CHBE ópticamente puro.
Este artículo estudia la síntesis asimétrica COBE de (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato (CHBE). Como catalizadores, las células de E. coli expresan simultáneamente una carbonil reductasa de Candida magnolia E y un gen de glucosa deshidrogenasa de Bacillus megaterium. En el sistema bifásico agua/disolvente orgánico, la concentración de (S)-CHBE en la fase orgánica puede alcanzar 2,58 M (430 g/l) y el rendimiento molar puede alcanzar el 85 %. Los subproductos de E. coli S1 y GDH también alcanzan 1,25 M (208 g/l). El COBE es inestable en la fase acuosa, por lo que (S)-CHBE se puede producir de forma continua en agua monofásica. En este caso, la conversión adecuada de NADP+ a CHBE alcanza 21.600 mol/mol. En este sistema, la rotación óptica del CHBE formado es 100% de exceso enantiomérico. Es relativamente sencillo utilizar E. coli HB101 que porta plásmidos que contienen genes S1 y GDH como catalizador para la reducción asimétrica en fase acuosa. Además, este sistema no requiere GDH comercial ni disolventes orgánicos. Por tanto, este sistema es muy conveniente para la síntesis práctica de (S)-CHBE con actividad óptica pura.
El 4-cloro-3-hidroxibutirato ópticamente activo es un componente quiral útil para la síntesis de fármacos. El enantiómero (R) es el precursor de la l-carnitina (Zhou et al., 1983), mientras que el enantiómero (S) es la reducción de la hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) Materias primas importantes para los inhibidores de enzimas (Karanewsky et Muchos estudios han descrito la reducción asimétrica microbiana o enzimática del 4-cloro-3-oxobutirato (Aragozzini y Valenti 1992; Bare et al. 1991; Hallinan et al. 1995; Patel et al. 1992; Shimizu et al. 1990; Wong et al. 1985) reducción basada en levadura de panadería (Zhou et al. 1983). Anteriormente hemos demostrado que las células Candida magnolia AKU4643 reducen el éster etílico del ácido 4-cloro-3-oxobutirico (COBE) a (S)-CHBE (yaso) con una pureza óptica del 96% de exceso enantiomérico (p. ej.) Hara et al., 1999 ). Dado que esta levadura tiene al menos tres reductasas estereoselectivas diferentes (Wada et al., 1998, 1999a, b), el (S)-CHBE producido por esta levadura no es ópticamente puro.
A partir de estas tres enzimas, se purificó y caracterizó en detalle una carbonil reductasa dependiente de NADPH, denominada S1 (Wada et al., 1998). Clonamos y secuenciamos el gen que codifica S1 y lo sobreexpresamos en células de E. coli. Este transformante de E. coli reduce el COBE a (S)-CHBE ópticamente puro en presencia de glucosa, NADP+ y glucosa deshidrogenasa (GDH) disponible comercialmente como generador de cofactor (Yasohara)
et al., 2000). .
Aquí describimos la construcción de tres transformantes de E. coli que coexpresan los genes GDH de C. magnolia S1 y B. megaterium y analizamos la reducción de COBE catalizada por estas cepas. Informes anteriores sobre la reducción enzimática de COBE a (R)-CHBE con una pureza óptica del 92% e.e. (Kataoka et al., 1999; Shimizu et al. (1990)) recomendaron una reacción de sistema de dos fases con disolvente orgánico para reacción enzimática o reducción microbiana, porque el sustrato (COBE) es inestable en solventes acuosos e inactiva la enzima. Estudiamos la reducción de COBE a (S) -CHBE ópticamente puro por transformantes de E. coli en reacciones de sistemas acuosos y discutimos esto. este sistema de reacción en aplicaciones industriales.
El éster etílico del ácido (S)-4-cloro-3-hidroxibutírico ópticamente activo es un compuesto quiral importante en la síntesis de preparaciones farmacéuticas. La forma de L-carnitina es la base. material para inhibidores de hidroximetilglutaril-CoA reductasa. Muchos estudios describen la reducción asimétrica de COBE mediante microorganismos o enzimas a base de levadura de panadería. Anteriormente se sabía que COBE se catalizó para producir CHBE con una pureza óptica del 96% mediante el uso de células de la especie Candida magnolia AKU4643. Hay al menos tres reductasas estereoselectivas en esta levadura y el CHBE producido por esta levadura no es óptico puro. De estas tres enzimas, la carbonil reductasa dependiente de NADPH, clonamos y secuenciamos el gen que codifica S1 y lo sobreexpresamos en E. coli transformada. células para producir CHBE óptico puro a partir de glucosa, NADP+ y glucosa deshidrogenasa comercial como promotores de factores coenzimáticos.
Construimos B. megaterium S1 y GDH expresados en estas tres células transformadas de E. coli y analizamos la reducción catalítica de. COBE por estas cepas. Informes anteriores han demostrado que la pureza óptica del CHBE producido por reducción enzimática de COBE puede alcanzar el 92%. También se menciona que el sustrato (COBE) es inestable en la fase acuosa y la enzima se elimina fácilmente. pasivado, por lo que la reacción tiene lugar en la fase disolvente orgánico/agua. El sistema está catalizado por enzimas o microorganismos. Estudiamos la reducción de COBE a CHBE óptico puro en un sistema monofásico de agua y discutimos las posibles aplicaciones de este sistema de reacción. en aplicaciones industriales.
Materiales y métodos.
Cepas bacterianas y plásmidos
Las cepas de E. coli utilizadas en este estudio fueron JM109 y HB101. en el que el gen GDH de B. megaterium se insertó en pKK223-3, proporcionado por el profesor I. Urabe de la Universidad de Osaka (Makino et al., 1989). Los plásmidos pSL301 y pTrc99A se adquirieron de Invitrogen (EE. UU.) y Amersham Pharmacia Biotech (). Reino Unido), respectivamente (Homma et al. 1995; Takahashi et al. (1995) se adquirieron de Shusa Takara Co., Ltd. (Japón)
Materiales y métodos
Cepas y plásmidos
Los E. coli utilizados en este experimento fueron JM 109 y HB 101. El gen GDH de Bacillus megaterium se insertó en el plásmido Pkk233-3, y el profesor Urabe de la Universidad de Osaka proporcionó el plásmido pGDA2 que porta el fragmento del gen GDH. Los plásmidos pSL301 y pTrc99A se compraron a la empresa estadounidense Invitrogen y a la británica, respectivamente. Los plásmidos pUC19 y pST28 se adquirieron de Takara Corporation de Japón.
El plásmido recombinante utilizado en este estudio se construyó de la siguiente manera (Figura 1): El plásmido pGDA2 se digirió dos veces con EcoRI y PstI para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,9 pares de kilobases (kb), incluido el gen GDH. Este fragmento se insertó en el sitio EcoRI-PstI del plásmido pSL301 para construir el plásmido pSLG.
El plásmido pSLG se digirió dos veces con EcoRI y XhoI para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,9 kb que incluía el gen GDH.
El plásmido recombinante utilizado en este experimento se construyó de la siguiente manera: el plásmido pGDA2 se digirió con EcoRI y PstI para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,9 kb que contenía el gen GDH. Este fragmento se insertó en el sitio de restricción EcoRI-PstI del plásmido Psl301 para construir el plásmido pSLG. El plásmido pSLG se transformó con EcoRI y XhoI.
Para construir el plásmido pNTS1G, este fragmento de 0,9 kb se insertó en el sitio EcoRI-SalI de pNTS1 como se describió anteriormente (Yasohara et al., 2000), y se construyó pntS1 para sobreproducir s 1. Para construir el plásmido pNTGS1, primero se generó el plásmido pNTG. Utilizando pGDA2 como plantilla, se prepararon dos cebadores sintéticos (cebador 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG y cebador 2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fragmento generado por PCR se digirió dos veces con NdeI y EcoRI, y luego se insertó en el sitio NdeI EcoRI del plásmido pUCNT, que se construyó a partir de pUC19 y pTrc99A, como se informó (Nanba et al., 1999), para obtener pNTG. Para construir el plásmido pNTGS1, se prepararon dos cebadores sintéticos (cebador 3, gccgaattctaagggttaataatgctaagaacttctccaacg y cebador 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC) utilizando pUCHE que contiene el gen S1 como plantilla. El fragmento generado por PCR se digirió dos veces con EcoRI y SalI y luego se insertó en el sitio EcoRI-SalI de pNTG para obtener pNTGS1. El plásmido pNTS1G, pNTGS1 o pNTG se transformó en E. coli HB101.
Construya PNTS1 para sobreexpresar el S1 mencionado anteriormente. Este fragmento de 0,9 kb se insertó en el sitio de restricción EcoRI-SalI de pNTS1 para construir pNTS1G. Para construir el plásmido pNTGS1, primero es necesario construir pNTG. La reacción de PCR requiere dos cebadores sintéticos (cebador 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG y cebador 2, TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) y pGDA2 como plantilla. El fragmento obtenido por PCR se digirió con NdeI y EcoRI y se insertó en el sitio de restricción NdeI EcoRI del plásmido pUCNT para obtener pNTG. Según los informes, pUCNT consta de pUC19 y pTrc99A. Para construir el plásmido pNTGS1, dos cebadores sintéticos (cebador 3, GCGGATCTAAGTTAAATGGCTAAGATTCCAACG y cebador 4, GCGGTCGACTTAGGAAGCGTAGCCCCCCGTC) incluyeron el gen S1 como plantilla. El fragmento del producto de la PCR se digirió con EcoRI y SalI y luego se insertó en el sitio de digestión EcoRI-SalI de pntg para obtener pntg1. Todos los plásmidos pNTS1G, pNTGS1 o pNTG se introdujeron en E. coli HB101.
El plásmido pGDA2 se digirió dos veces con EcoRI y PstI para aislar un fragmento de ADN de aproximadamente 0,9 kb que incluía el gen GDH. Para construir el plásmido pSTVG, este fragmento se insertó en los sitios EcoRI-PstI del plásmido pSTV28. El plásmido pSTVG se transformó en E. coli HB101.
El plásmido pGDA2 se digirió con EcoRI y PstI para obtener un fragmento de ADN de 0,9 kb que contenía el gen GDH. Para construir el plásmido pSTVG, este fragmento se insertó en los sitios de restricción EcoRI-PstI del plásmido pSTV28. El plásmido pSTVG se introdujo en E. coli HB101.
Medio y cultivo
El medio 2×YT consta de 1,6% de triptona bacteriana, 1,0% de extracto de levadura
y 0,5% de cloruro de sodio, pH 7,0.
E. coli HB 101 que porta pNTS1,
Inocular pNTG, pNTS1G o pNTGS1 en un tubo de ensayo que contenga
2 ml de medio 2×YT suplementado con 0,1 mg/ml de ampicilina,
p>
Luego incubar a 37°C durante 65±05 horas mientras se agita de un lado a otro.
Transferir este precultivo (0,5 ml) a un agitador de 500 ml.
Matraz que contiene 100 ml de medio 2×YT. Las células se cultivaron a 37°C durante 65.438 ± 03 horas con agitación recíproca. También se cultivaron E. coli HB101 que portaban pNTS1 y pSTVG en medio YT 2x suplementado con 0,1 mg/ml de ampicilina y 0,1 mg/ml de cloranfenicol.
Medio y cultivo bacteriano
El medio 2*YT contiene 1,6% de triptona para bacterias, 1,0% de extracto de levadura, 0,5% de NaCl, pH 7,0.
Inocular E. coli HB101 que porta pNTS1, pNTG, pNTS1G o pNTGS1 en 2 ml de medio 2*YT que contenga 0,1 mg/ml de ampicilina y agitar a 37 °C durante 15 horas. Inocular 0,5 ml de solución bacteriana en 100 ml de medio 2*YT en un matraz de 500 ml. Incubar en agitador a 37°C durante 65,438 ± 03 horas. Se cultivó E. coli HB101 que albergaba plásmidos pNTS1 y pSTVG en medio 2*YT de manera similar, excepto que se añadieron al medio 0,1 mg/ml de ampicilina y 0,1 mg/ml de cloranfenicol.
Preparación de extractos libres de células y ensayo enzimático
Las células se recolectaron a partir de 100 ml de medio de cultivo mediante centrifugación, se suspendieron en 50 ml de tampón fosfato potásico 100 mM (pH 6,5) y se Luego pasó por fragmentación ultrasónica. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación; el sobrenadante se recuperó como un extracto libre de células. La actividad de la carbonil reductasa S1 (actividad reductora de COBE) se determinó espectrofotométricamente de la siguiente manera: la mezcla de ensayo consistió en tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5), NADPH 0,1 mM y COBE 1 mM. La reacción se incubó a 30 °C y se controló la disminución de la absorbancia a 340 nm. La mezcla de ensayo para la actividad de GDH consistió en tampón Tris-HCl 1 M (pH 8,0), glucosa 100 mM y NADP+ 2 mM. La reacción se incubó a 25°C y se controló el aumento de la absorbancia a 340 nm. Una unidad de S1 o GDH se define como la cantidad de reducción catalítica de 1 μmol de NADP+ u oxidación de 1 μmol de NADPH por minuto, respectivamente. Medición de la concentración de proteínas con kit de análisis de proteínas que contiene Coomassie Brilliant Blue (Nacalai Tesque, Japón),
utilizando albúmina sérica bovina como estándar (Bradford 1976).
Extracto libre de células e identificación de enzimas
Se centrifugaron 100 ml de medio de cultivo para recolectar las células bacterianas, se suspendieron en 50 ml de 0,1 mol/LpH 6,5 y luego se rompieron mediante sonicación. Los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación y el sobrenadante recogido es un extracto libre de células. Utilice un espectrofotómetro para medir la actividad de la carbonil reductasa S1 de la siguiente manera: la mezcla medida incluye 0,1 mol/L de tampón de dihidrógeno fosfato de potasio, pH 6,5, 0,1 mMNADPH y 1 mMCOBE. La reacción se llevó a cabo a 30°C y se controló en cualquier momento la absorbancia a 340 nm. La mezcla utilizada para medir la GDH incluía: tampón Tris-HCl 1 m, pH 8,0, glucosa 100 mM y NADP+ 2 mM. La reacción se llevó a cabo a 25°C y se controló la absorbancia a 340 nm. Una unidad de S1 o GDH se define como la reducción catalítica de 1 μmol de NADP+ o la oxidación de 1 μmol de NADPH por minuto. La proteína se midió utilizando un reactivo proteico que contenía Coomassie Brilliant Blue, con albúmina sérica bovina como estándar.
Estudio de estabilidad enzimática
Se añadió 1 ml de extracto libre de células de E. coli HB101 que alberga pNTS1 (S1: 20 U/ml) a tampón fosfato potásico 100 mM (pH 6.5) se mezcló en un recipiente cerrado con un volumen igual de cada disolvente orgánico probado.
Después de agitar la mezcla a 30°C durante 48 horas, se determinó la actividad enzimática restante en la fase acuosa como se describe anteriormente. Se incubaron mezclas que contenían tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,5), S1 (20 U/ml) y diversas concentraciones de CHBE a 30 °C durante 24 h para estudiar la estabilidad de la enzima en presencia de CHBE. La actividad enzimática restante se determinó como se describe anteriormente.
Estudio de estabilidad enzimática
Diluir 1 ml de extracto libre de células de E. coli HB101 que contiene el plásmido pNTS1 con un volumen igual de tampón fosfato dipotásico 100 mM (pH 6,5). disolventes orgánicos. Después de agitar la mezcla a 30ºC durante 48 horas, la actividad enzimática restante en la fase acuosa fue la actividad enzimática mencionada anteriormente.
Reducción de COBE utilizando células de E. coli que expresan el gen S1 y células de E. coli que expresan el gen GDH en una reacción de sistema de dos fases
La mezcla de reacción contenía 15 ml de E. coli HB101 que lleva medio de cultivo pNTG, 17 ml de medio de cultivo de E. coli HB101 que lleva pNTS1, 1,6 mg de NADP+, 4 g de glucosa, 2,5 g de COBE, 25 ml de acetato de n-butilo y aproximadamente 25 mg de Triton X-655. Ajuste el pH. de la mezcla de reacción con hidróxido de sodio 5 M. Controlarla a 6,5. A las 2 horas, se añadieron a la mezcla de reacción 1,25 g de COBE y 2,5 g de glucosa. Para comparar la respuesta de los transformantes de E. coli que coexpresan los genes GDH y S1, se reemplazaron 30 ml de medio de cultivo de E. coli con HB101 que llevaba pNTS1G y HB101 de E. coli que llevaba pNTS1. Otros componentes y procedimientos son los mismos que los anteriores.
Reacción de reducción de células de E. coli que expresan el gen S1 y el gen GDH en un sistema de reacción de dos fases
La mezcla contiene 65438+25 ml de líquido bacteriano de E. coli HB101 con Plásmido pNTG, 1017 ml de líquido bacteriano de E. coli HB101 con plásmido pNTS1, 1,6 mg de NADP+, 4 g de glucosa, 2. El valor del pH se controló a 6,5 con una solución de NaOH 5 M. Después de dos horas de reacción, se añadieron a la mezcla 1,25 gramos de glucosa y 2,5 gramos de glucosa. Al comparar la expresión de los genes GDH y S1 en células transformadas de E. coli, E. coli HB10130ml con plásmido pNTS1G reemplazó a E. coli HB101 con plásmidos pNTG y pNTS1. Otros componentes y pasos son similares al método anterior.
En la reacción del sistema de dos fases, el COBE se reduce a (S)-CHBE
La mezcla de reacción contiene 50 ml del medio de cultivo del transformante E. coli HB101, 3,2 mg de NADP+, 11 g de glucosa, 10 g de COBE, 50 ml de acetato de n-butilo y aproximadamente 50 mg de Triton X-100. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C y el pH se controló a 6,5 con hidróxido de sodio 5 M. Se añadieron 5 g de COBE/5,5 g de glucosa y 10 g de COBE/11 g de glucosa a la mezcla de reacción a las 3 y 7 horas respectivamente; se añadieron 3,2 mg de NADP+ a las 26 horas.
COBE reducido para producir (S)-CHBE en un sistema de dos fases
La mezcla de reacción contenía 50 ml de medio de cultivo celular transformado con E. coli HB 101, 3,2 mg de NADP+, 11 g
Glucosa, 10 g de COBE, 50 ml de ácido butírico, aproximadamente 50 mg de polietilenglicol octilfenil éter Triton X-100.
Mezclar uniformemente a 30°C y controlar el pH a 6,5 con solución de NaOH 5M. Agregue 5 g de COBE y 5,5 g de glucosa respectivamente a la tercera hora o agregue 10 g de COBE y 11 g de glucosa respectivamente a la séptima hora, y agregue 3,2 g de NADP+ respectivamente a las 26 hora.
COBE se reduce a (S)-CHBE en una reacción de sistema de agua
La mezcla de reacción consta de 50 ml de fluido de cultivo transformante de Escherichia coli HB101, 3,1 mg de NADP+, 11 g de glucosa y unos 50 mg de Compuesto de Triton X-100. La mezcla de reacción se agitó a 30°C. Se añadieron continuamente 15 g de COBE a través de un microalimentador a una velocidad de aproximadamente 0,02 g/min durante aproximadamente 65.438 ± 02 horas. El pH de la mezcla de reacción se controló a 6,5 con hidróxido de sodio 5 M.
La mezcla de reacción se extrajo con 65438 + 000 ml de acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó al vacío.
COBE se reduce a (S)-CHBE en fase acuosa
El sistema de reacción está compuesto por 50 ml de E. coli HB101, 3,1 mna DP+, 11 g de glucosa y unos 50 mg de polietilenglicol líquido bacteriano transformado con éter de octilfenilo Triton X-100. La mezcla de reacción se añadió continuamente al sistema a 30°C a una velocidad de 0,02 g/min en 65438 ± 02 horas. El valor del pH se controló a 6,5 con una solución de NaOH 5 M. La mezcla de reacción se extrajo con 100 ml de acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se deshidrató al vacío.
Análisis
Centrifugar la mezcla de reacción para obtener la capa orgánica, y analizar CHBE y COBE mediante cromatografía de gases. La pureza óptica de CHB E se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) como se describió anteriormente (Yasohara et al., 1999).
Enzimas y productos químicos
Las enzimas de restricción y la ADN polimerasa se adquirieron de
Tara Shuzo (Japón). COBE (peso molecular: 164,59) se adquirió de Tokyo Chemical Industry (Japón). Se preparó CHBE racémico (peso molecular: 166,60) utilizando NaBH4. Todos los demás productos químicos utilizados eran de grado analítico
Disponibles comercialmente.
Análisis
El CHBE y COBE de la capa orgánica obtenida por centrifugación de la mezcla de reacción se determinaron mediante cromatografía de gases. La pureza óptica de COBE se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución como se describe anteriormente.
Enzimas y reactivos químicos
La endonucleasa de restricción y la ADN polimerasa se adquirieron de Takara Company, el COBE (peso molecular: 164,59) se adquirió de Tokyo Kasei Kogyo Company, el CHBE racémico (peso molecular: 166.6) sintetizado a partir de COBE y NaBH4. Todos los demás reactivos químicos eran reactivos comerciales y de grado analítico.
Construcción de transformantes de E. coli que sobreproducen S1 y GDH
Para expresar los genes de la carbonil reductasa S1 y GDH en la misma célula de E. coli, se construyeron cuatro vectores de expresión ( Figura 1). Los plásmidos pNTS1G y pNTGS1 contienen el gen S1 de Magnoliaceae, el gen GDH de Bacillus megaterium, el promotor lac de pUC19 y el terminador de pTrc99A. El plásmido pNTS1 contiene el gen S1, el promotor lac de pUC19 y el terminador de pTrc99A. Las actividades enzimáticas en extractos libres de células de transformantes de E. coli se muestran en la Tabla 1. No se detectó actividad S1 o GDH en células E. coli HB101 que portaban el plásmido vector pUCNT. E. coli HB101 que porta pNTS654 38+0G o pNTGS1 mostró actividad S1 y GDH sin inducción de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG). La actividad S1 de estos dos transformantes fue menor que la actividad GDH. Para obtener transformantes cuya actividad S1 fuera igual o mayor que el nivel de actividad de GDH, utilizamos el vector de baja copia pSTV28 (Homma et al., 1995; Takahashi et al., 1995) para expresar el gen GDH. Es posible aumentar la actividad S1 reduciendo la actividad de GDH. El plásmido pSTVG contiene el gen GDH, el promotor lac, el gen de resistencia al cloranfenicol y el origen de replicación de pACYC184 para compatibilidad con el plásmido pNTS1. En E. coli HB101 que porta pNTS65438 +0 y pSTVG, la actividad de S65438 +0 es mayor que la actividad de GDH, pero este nivel de GDH puede ser demasiado bajo para regenerarse en la reacción de reducción de COBE como se describe a continuación.
Construcción de células transformadas de E. coli para la sobreproducción de S1 y GDH
Para expresar los genes de la carbonil reductasa S1 y GDH en la misma célula de E. coli, se necesitan cuatro vectores de expresión. ser construido. Los plásmidos pNTS1G y pNTGS1 contienen el gen S1 de Magnolia E, el gen GDH de Bacillus megaterium, el promotor LAC de pUC19 y el terminador de pTrc99A. El plásmido pNTS1 contiene el gen S1.
Las actividades enzimáticas de extractos libres de células de células transformadas en E. coli se muestran en la Tabla 1. Las actividades S1 y GDH no pudieron detectarse en células de E. coli que portaban el plásmido de transferencia pUCNT. Los plásmidos que portan pNTS1G o pNTGS1 tienen actividades S1 y GDH sin inducción de IPTG. En ambas cepas transformadas, S1 fue menos activa que GDH. Para obtener cepas transformadas de E. coli con actividad S1 igual o mayor que GDH, utilizamos el vector de baja copia pSTV28 para expresar el gen GDH. Puede aumentar la actividad S1 al reducir la actividad de GDH. El plásmido pSTVG contiene el gen GDH, el promotor lac, el gen de resistencia al cloranfenicol y el origen de replicación de pACYC184, que es compatible con pNTS1. En células transformadas de E. coli que portan pNTS1 y pSTVG, la actividad de S1 es mayor que la de GDH, pero la actividad de GDH puede ser demasiado baja para regenerarse en la reacción de reducción de COBE.
Es demasiado largo y no se puede publicar debido al número limitado de caracteres. No me importa el puntaje. Rara vez inicio sesión. Esto debería considerarse ingeniería genética. Lo traduje yo mismo antes, pero no fue muy bueno. Si lo deseas puedes contactar conmigo a mi dirección de correo electrónico. iamecho23@163.com