En primer lugar necesitamos saber si el sistema de expresión de los péptidos antimicrobianos es eucariota o procariótico. La idea para responder a la pregunta es:
1. Utilice genbank para buscar secuencias conocidas. Si no, debe secuenciarlo usted mismo.
2. Detectar las secuencias de 15 aminoácidos en el extremo N y C-terminal respectivamente, y diseñar cebadores basados en la degeneración y preferencia de codones.
3. Tras diseñar los cebadores, extraer el ARN total y amplificar los genes de péptidos antimicrobianos mediante RT-PCR.
4. Secuenciación: conectar el gen objetivo al vector T, transformarlo en un clon (como TG1), realizar una detección con puntos azules y blancos, identificar los resultados de la recombinación mediante PCR y digestión enzimática, y secuenciar. utilizando el plásmido recombinante como plantilla, verifique la precisión del gen objetivo.
5. Elija el sistema de expresión y el vector adecuados. El sistema de expresión procariótica de Escherichia coli se puede utilizar para digerir dos veces el gen diana del plásmido recombinante que contiene el vector T, luego conectarlo a un vector adecuado (como pET28a), transformarlo en una bacteria de clonación (como TG1), y realizar clonaciones a gran escala. Los resultados de la recombinación se confirmaron mediante digestión enzimática y PCR. También se pueden utilizar sistemas de expresión eucarióticos. Si el péptido antimicrobiano modificado es una proteína expresada en eucariotas que se glicosila y modifica fácilmente después de la traducción, será difícil expresar una proteína con una estructura y función similar a la de un producto natural utilizando un sistema de expresión procariota. Por tanto, se utilizó un sistema de expresión eucariota. Mediante la transposición de sitio específico, se pueden insertar fácilmente genes extraños en el vector lanzadera del virus y luego el ADN recombinante que contiene los genes extraños se extrae y se transfecta en células de insecto para obtener el virus recombinante que contiene los genes extraños para expresar la proteína diana.
6. Expresión, aislamiento y purificación de productos. El sistema de expresión procariota consiste en transformar el plásmido recombinante en bacterias de expresión de E. coli adecuadas (tales como BL21, BL21*, etc.). ), agregar inductor IPTG para inducir la expresión, identificar los productos de expresión mediante electroforesis SDS-PAGE, inducir bacterias mediante ultrasonido, realizar electroforesis SDS-PAGE en el sobrenadante y precipitar respectivamente para determinar si la proteína es proteína sobrenadante o cuerpo de inclusión, y luego tomar medidas correspondientes según el método de expresión de proteínas. El baculovirus Bombyx mori que contiene genes extraños también se puede utilizar para infectar larvas o pupas de gusanos de seda para la expresión eucariota, y la proteína expresada tiene actividad natural.
7. Asegurar que las actividades sean consistentes. A conejos adultos de Nueva Zelanda se les inyectó por vía subcutánea proteína purificada emulsionada varias veces utilizando métodos de inmunización para obtener los anticuerpos correspondientes. Mediante Western blot y Elisa, la proteína objetivo se une específicamente al anticuerpo y Elisa se utiliza para detectar el título del anticuerpo para garantizar una actividad constante.
Espero poder ayudarte un poco.