La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que se utiliza para amplificar fragmentos de ADN específicos. Puede considerarse como un tipo especial de replicación del ADN in vitro.
La ADN polimerasa I se descubrió por primera vez en 1955, y el Dr. H. Klenow descubrió el fragmento Klenow de E. coli con más valor experimental y practicidad a principios de la década de 1970. Sin embargo, dado que esta enzima no es resistente a altas temperaturas y puede desnaturalizarse a altas temperaturas, no es adecuada para reacciones en cadena de la polimerasa de desnaturalización a altas temperaturas. La enzima utilizada hoy en día (Taq polimerasa para abreviar) se aisló de bacterias en aguas termales en 1976. Es una enzima ideal debido a su resistencia a altas temperaturas, pero se utilizó ampliamente después de la década de 1980. El concepto prototipo original de PCR era una replicación de reparación genética similar, propuesta por el Dr. Kjell Kleppe en 1971. Publicó el primer experimento de replicación de genes simple y corto (análogo a los dos primeros ciclos de PCR). La PCR desarrollada hoy fue desarrollada por el Dr. Cary B. Mullis en 1983. El Dr. Mullis trabajaba entonces para una empresa de PE, por lo que la empresa de PE tenía una posición especial en el campo de la PCR. El Dr. Mullis publicó el primer artículo relacionado en 1985 con Zhai Si y otros. Desde entonces, la aplicación de la PCR ha avanzado a pasos agigantados, y se puede decir que la calidad de los artículos relacionados no tiene comparación con muchos otros métodos de investigación. Posteriormente, la tecnología de PCR se utilizó ampliamente en la investigación biológica y en aplicaciones clínicas, convirtiéndose en la tecnología más importante en la investigación de biología molecular. Mullis también ganó el Premio Nobel de Química en 1993.
[Editar este párrafo] [Principio de PCR]
La replicación semiconservadora del ADN es una forma importante de evolución y generación biológica. El ADN de doble cadena se puede desnaturalizar y fundir en cadenas simples bajo la acción de varias enzimas. Con la participación de la ADN polimerasa, se puede copiar en el mismo mejillón de dos moléculas según el principio del emparejamiento de bases complementarias. Los experimentos han descubierto que el ADN puede desnaturalizarse y fundirse a altas temperaturas, y puede replegarse en dobles hebras cuando se enfría. Por lo tanto, la desnaturalización y renaturalización del ADN se puede controlar mediante cambios de temperatura, y la ADN polimerasa y el dNTP pueden completar la replicación in vitro de genes específicos agregando cebadores diseñados.
Sin embargo, la ADN polimerasa se inactiva a altas temperaturas, por lo que es necesario añadir una nueva ADN polimerasa en cada ciclo, lo que no sólo es engorroso de operar, sino también costoso, lo que restringe la aplicación y el desarrollo de la tecnología de PCR. .
El descubrimiento de la enzima ADN polimerasa termoestable Taq supuso un hito en las aplicaciones de PCR. La enzima puede soportar altas temperaturas superiores a 90°C sin perder actividad, lo que hace que la tecnología de PCR sea muy simple y reduce en gran medida los costos. La tecnología de PCR se ha utilizado ampliamente y se ha aplicado clínicamente gradualmente.
El principio básico de la tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad se basa en cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-hibridación-extensión: ① Desnaturalización del ADN molde: después de calentar el ADN molde a aproximadamente 93 °C durante un cierto período de tiempo, el ADN bicatenario del ADN molde o el doble -El ADN amplificado por PCR se disocia en ADN monocatenario, de modo que pueda combinarse con el cebador para prepararse para la siguiente ronda de reacción (2) Recocido (renaturalización) del ADN molde y el cebador: después del molde; El ADN se calienta y se desnaturaliza en una sola hebra, la temperatura desciende a aproximadamente 55 °C y el cebador y el ADN molde se emparejan y unen con la secuencia complementaria monocatenaria. ③ Extensión del cebador: el conjugado plantilla-cebador de ADN utiliza dNTP como materia prima de reacción; material y la secuencia diana como plantilla bajo la acción de la TaqDNA polimerasa. De acuerdo con los principios de emparejamiento complementario de bases y replicación semiconservativa, se puede sintetizar una nueva cadena de replicación semiconservadora que es complementaria a la cadena de ADN plantilla mediante repetición. Después de los tres procesos de desnaturalización-hibridación-extensión, se pueden obtener más "cadenas de replicación semiconservadoras". Esta nueva cadena se puede utilizar como plantilla para el siguiente ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar un ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar un millón de veces en 2 a 3 horas.
[Editar este párrafo][Sistema de reacción de PCR y condiciones de reacción]
1. Sistema de reacción de PCR estándar
10× tampón de amplificación 10μl
200μl de mezcla de cuatro dNTP.
Primer 10~100μl
ADN plantilla 0,1~2 μg
ADN polimerasa Taq 2,5μl
Mg2+1,5ml mol/L
Añadir doble o triple 100μl de agua destilada
Cinco elementos de la reacción de PCR: Hay cinco sustancias principales implicadas en la reacción de PCR, que son:
Cebadores (Los cebadores de PCR son fragmentos de ADN y los cebadores para la replicación del ADN intracelular son cadenas de ARN), enzimas, dNTP, plantillas y tampones (requiere Mg2+).
Existen muchos métodos para diseñar cebadores, que están determinados por el propósito de la PCR en el experimento. Pero el principio básico es el mismo.
Hay dos fuentes principales de enzimas utilizadas en la PCR: Taq y Pfu. de dos bacterias termófilas diferentes. Entre ellos, la eficiencia de amplificación de Taq es alta, pero se producen discrepancias. La eficiencia de amplificación de Pfu es débil, pero tiene función de corrección de errores. Por lo tanto, se deben tomar diferentes decisiones según las necesidades del uso real.
El ADN molde utilizado para la amplificación puede proceder de cualquier fuente, pero existen dos principios. En primer lugar, la pureza debe ser alta y, en segundo lugar, la concentración no puede ser demasiado alta para evitar la inhibición.
La composición de la solución tampón es la más compleja, incluyendo generalmente cuatro ingredientes activos excepto agua: sistema tampón, que generalmente utiliza sistema tampón HEPES o MOPS, generalmente se utilizan iones de potasio para cationes monovalentes, pero también pueden usarse; usarse en circunstancias especiales Los cationes divalentes, a saber, los iones de magnesio, se determinan de acuerdo con el sistema de reacción y no es necesario ajustarlos excepto en circunstancias especiales. Los componentes auxiliares, como DMSO y glicerol, se usan principalmente para mantener la actividad; de la enzima y ayudan al ADN a contactar con la estructura sinuosa.
2. Diseño del cebador de PCR
Hay dos cebadores en la reacción de PCR, a saber, el cebador 5' y el cebador 3'. Diseñar cebadores basados en una sola cadena de ADN (generalmente basados en cadenas de información). El cebador del extremo 5' es el mismo que la secuencia corta de ADN ubicada aguas arriba del extremo 5' del fragmento que se va a amplificar; El cebador es el mismo que la secuencia corta de ADN en el extremo 3' del fragmento que se va a amplificar.
Principios básicos del diseño del cebador
① Longitud del cebador: 15-30 pb, normalmente alrededor de 20 pb.
② Bases de cebador: el contenido de G+C debe ser del 40-60%. Muy poco G+C no favorece la amplificación, y demasiado G+C puede producir fácilmente bandas no específicas. Los ATGC se distribuyen preferentemente de forma aleatoria para evitar agrupaciones de más de 5 nucleótidos de purina o pirimidina.
③No debe haber ninguna secuencia complementaria en el cebador.
④ No debe haber secuencias complementarias entre los dos cebadores, especialmente superposición complementaria en el extremo 3'.
⑤La homología entre el cebador y la secuencia de la región de amplificación no específica no puede exceder el 70%. Las 8 bases en el extremo 3' del cebador no pueden contener una secuencia completamente complementaria fuera de la región a amplificar. De lo contrario, fácilmente conducirá a un aumento no específico.
⑥Las bases en el extremo 3' de la imprimación, especialmente la última y penúltima base, deben coincidir estrictamente. Lo mejor es elegir G y C.
⑦Las 5'. final de la imprimación Los extremos se pueden modificar. Como agregar sitios de restricción, introducir sitios de mutación, marcar con biotina, sustancias fluorescentes y digoxigenina, y agregar otras secuencias cortas, incluidos codones de inicio y codones de parada.
5. Software de diseño de imprimaciones
Primer Premier5.0 (búsqueda automática)*
VOligo6 (evaluación de imprimaciones)
Traje Vector NTI
vDNAsis
Womiga
vDNAstar
VPrimer3 (servicio online)
3.Preparación de plantillas
La plantilla para la PCR puede ser ADN o ARN.
La plantilla se basa principalmente en objetos de amplificación por PCR, que pueden ser muestras de patógenos como virus, bacterias y hongos. También pueden ser muestras fisiopatológicas como células, sangre, células del líquido amniótico, etc. Las muestras forenses incluyen manchas de sangre, manchas de semen, cabello, etc.
Los requisitos básicos para el procesamiento de muestras son la eliminación de impurezas y la purificación parcial de los ácidos nucleicos de la muestra. La mayoría de las muestras deben tratarse con SDS y proteinasa K, y las bacterias que son difíciles de alterar pueden tratarse con lisozima y EDTA. El ADN bruto obtenido se extrajo y se purificó con fenol y cloroformo, y luego se precipitó con etanol para que sirviera como plantilla para la reacción de PCR.
4. Control de las condiciones de la reacción de PCR
①①El tampón de reacción de PCR proporciona el pH adecuado y algunos iones.
②La concentración total de iones de magnesio debe ser superior a la de los dNTP; el uso habitual es 1,5 mmol/L.
(3) Concentración del sustrato dNTP se prepara a una concentración equimolar, 20 ~ 200 μm ol/l
④TaqDNA polimerasa 2,5 U (100 ul)
⑤ Concentración del cebador es generalmente 0,1 ~ 0,5 umol/L.
⑥Temperatura de reacción y tiempo de ciclo
La temperatura y el tiempo de desnaturalización son 95 °C, 30 s.
La temperatura y el tiempo de recocido son aproximadamente 5°C inferiores al valor de Tm de la imprimación, generalmente entre 45 y 55°C.
La temperatura y el tiempo de extensión son 72 ℃, 1 min/KB (dentro de 10 kB).
Valor Tm = 4 (g+c)+2 (a+t)
Número de ciclos: generalmente 25 ~ 30 veces. El número de ciclos determina el rendimiento de la amplificación por PCR. La concentración inicial de plantilla es baja y el número de ciclos se puede aumentar para lograr una amplificación eficaz. Sin embargo, el número de ciclos no se puede aumentar indefinidamente. El número general de ciclos es de aproximadamente 30 veces. Después de que el número de ciclos excede los 30, la actividad de la ADN polimerasa alcanza gradualmente la saturación y la cantidad de producto ya no aumenta con el número de ciclos, lo que resulta en el llamado "período de meseta".
[Editar este párrafo] [Pasos de la PCR]
El proceso de PCR estándar se divide en tres pasos:
1. ) : Bajo la acción del calor, los enlaces de hidrógeno de la plantilla de ADN bicatenario se rompen para formar ADN monocatenario.
2. Recocido (25 ℃ -65 ℃): la temperatura del sistema disminuye y los cebadores se combinan con la plantilla de ADN para formar dobles hebras parciales.
3. Extensión (70℃-75℃): Bajo la acción de la enzima Taq (alrededor de 72℃, la mejor actividad), utilizando dNTP como materia prima, extienda desde el extremo 5' del cebador hasta el extremo 3', sintetiza una cadena de ADN complementaria al molde.
Después de cada ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión, el contenido de ADN se duplica. Como se muestra en la figura:
En la actualidad, algunas PCR se pueden replicar en poco tiempo porque la región amplificada es muy corta, incluso si la actividad de la enzima Taq no es óptima, por lo que se puede cambiar a una Método de dos pasos, a saber, recocido y extensión, se lleva a cabo simultáneamente a 60 ℃ -65 ℃ para reducir un proceso de calentamiento y enfriamiento y aumentar la velocidad de reacción.
[Editar este párrafo] [Detección por PCR]
La reacción de PCR amplifica un número de copias alto, y la siguiente detección se convierte en la clave. La electroforesis en gel teñido con fluoresceína (EB) es el método de detección más utilizado. La especificidad de la detección por electroforesis no es muy alta, por lo que la hibridación no específica, como los dímeros de cebadores, puede provocar fácilmente errores de juicio. Sin embargo, debido a su simplicidad, se ha convertido en un método de detección convencional. En los últimos años, los métodos de detección representados por sondas fluorescentes han ido reemplazando gradualmente a la electroforesis.
[Editar este párrafo] [Características de la reacción de PCR]
Fuerte especificidad
Los determinantes específicos de la reacción de PCR son:
① El combinación específica y correcta de cebadores y ADN molde;
②El principio de emparejamiento de bases;
③La autenticidad de la reacción de síntesis de la ADN polimerasa Taq;
④La especificidad del gen objetivo y conservadurismo.
La combinación correcta de primers y plantillas es clave. La unión del cebador al molde y la extensión de la cadena del cebador siguen el principio de apareamiento de bases. Debido a la fidelidad de la reacción de síntesis de la polimerasa y la resistencia a altas temperaturas de la TaqDNA polimerasa, la combinación (renaturalización) de la plantilla y el cebador en la reacción se puede realizar a una temperatura más alta, la especificidad de la combinación aumenta considerablemente y la fragmento de gen diana amplificado Se puede mantener una alta precisión. Al seleccionar regiones genéticas objetivo con alta especificidad y conservación, la especificidad será mayor.
Alta sensibilidad
La cantidad de producto de PCR aumenta exponencialmente y la plantilla inicial que se va a probar se puede amplificar desde el nivel de picogramos (pg=10-12) hasta el nivel de μg. =-6. Se puede detectar una célula diana entre 654,38+0 millones de células; en la detección de virus, la sensibilidad de la PCR puede alcanzar 3 RFU (unidades formadoras de placa), la tasa de detección más baja es de 3 bacterias;
Simple y rápido
La ADN polimerasa Taq resistente a altas temperaturas se utiliza en reacciones de PCR. Después de agregar la solución de reacción de una vez, la reacción de desnaturalización-hibridación-extensión se realiza en la solución de amplificación de ADN y en un baño de agua. La reacción de amplificación generalmente se completa en 2 a 4 horas. Los productos de amplificación generalmente se analizan mediante electroforesis, que no requiere isótopos, por lo que no hay contaminación radiactiva y es fácil de promover.
La pureza del ejemplar es baja.
No es necesario aislar virus o bacterias ni cultivar células, y se pueden utilizar ADN y ARN crudos como plantillas de amplificación. Puede usarse directamente para la amplificación de ADN y la detección de muestras clínicas como sangre, líquido de cavidades corporales, enjuague bucal, cabello, células y tejidos vivos.
[Editar este párrafo][Parámetros del ciclo][PCR]
1, desnaturalización inicial.
La desnaturalización completa del ADN molde y la activación completa de la enzima PCR son muy importantes para el éxito de la PCR. Se recomienda que el tiempo de calentamiento consulte las instrucciones del reactivo. El tiempo de activación de la enzima Taq no modificada es generalmente de dos minutos.
2. Paso de desnaturalización del ciclo
Generalmente, 95°C durante 30 segundos en el ciclo son suficientes para desnaturalizar completamente varias secuencias de ADN objetivo. Si es posible, el tiempo de este paso. se puede acortar.
Si el tiempo de desnaturalización es demasiado largo, la actividad enzimática se dañará, y si el tiempo de desnaturalización es demasiado corto, la secuencia objetivo no se desnaturalizará por completo, lo que puede conducir fácilmente a un fallo de amplificación.
3. Recocido del imprimador
La temperatura de recocido debe determinarse desde muchos aspectos. Generalmente, la temperatura de hibridación se reduce apropiadamente según el valor de Tm del cebador y la longitud de amplificación. Luego haz una estimación basada en este experimento.
La temperatura de recocido tiene un gran impacto en la especificidad de la PCR.
4. Extensión del cebador
La extensión del cebador generalmente se realiza a 72°C (la temperatura óptima de la enzima Taq). Sin embargo, este paso se puede omitir cuando la longitud de amplificación es corta y la temperatura de recocido es alta.
El tiempo de extensión depende de la longitud del fragmento amplificado. Generalmente se recomienda que sea superior a 1000 pb. Se establece en 1 min/kbp utilizando Pfu y sus derivados.
5. Número de ciclos
La mayoría de las PCR contienen entre 25 y 40 ciclos, que son propensos a una amplificación no específica.
6. La última extensión
Después del último ciclo, la reacción se mantiene a 72°C durante 5-15 minutos para extender completamente el cebador y templar el producto monocatenario. productos de doble hebra.
(Contaminación y falsos positivos en PCR
La contaminación en PCR proviene principalmente de
1, contaminación cruzada entre muestras;
2 .Restos de productos PCR anteriores