Aplicación de la ingeniería celular en plantas
⑴Aplicación de la tecnología de micropropagación
La tecnología de micropropagación utiliza órganos, tejidos, células de plantas o se utilizan protoplastos como explantes , y la regeneración de las plantas se realiza en condiciones de cultivo in vitro. La aplicación de la tecnología de micropropagación no sólo puede superar la grave separación de la descendencia causada por la reproducción sexual de especies altamente heterocigotas, como la papaya australiana, sino que también puede utilizarse para propagar rápidamente especies famosas o en peligro de extinción, como las piñas y las fresas. Las principales especies de árboles regeneradas mediante tecnología de micropropagación incluyen papaya, cítricos, longan, lichi, manzana, pera, uva, fresa, plátano, etc. , logrando así la producción comercial.
Se pueden obtener plántulas libres de virus, como manzanas y fresas, mediante el cultivo de la punta del tallo o la tecnología de microinjertos. Además, en el proceso de cultivo de tejidos, como cultivo de callos, cultivo en suspensión celular, cultivo de protoplastos, etc. Al cambiar condiciones como el valor del pH, la temperatura y la concentración de iones, se puede aumentar la variación y seleccionar mutantes excelentes, abriendo una nueva vía para el cultivo de nuevas variedades.
Los callos, las células en suspensión y los protoplastos son buenos materiales receptores para la transformación genética. La regeneración de plantas cultivadas in vitro también es un paso importante para lograr la transformación genética de las plantas.
Además, la tecnología de micropropagación proporciona un nuevo método para la conservación del germoplasma. En condiciones de cultivo in vitro, muchos recursos de germoplasma pueden conservarse durante mucho tiempo mediante un crecimiento lento y un tratamiento a baja temperatura, y pueden recolectarse, intercambiarse, conservarse y aplicarse entre diferentes países y regiones, es decir, el establecimiento de un "gen". banco" para aprovechar los recursos de germoplasma compartidos globalmente. Por ejemplo, el Centro de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina en Bélgica tiene un gran banco de germoplasma de banano mantenido en tubos de ensayo.
⑵ Cultivo celular a gran escala y producción de metabolitos secundarios útiles
El cultivo a gran escala de metabolitos secundarios útiles es otro campo de aplicación importante de la ingeniería de células vegetales. A través de la tecnología de ingeniería celular, podemos estimular la síntesis y acumulación de algunos metabolitos secundarios importantes en las plantas, y luego separarlos y purificarlos, como algunos medicamentos valiosos, especias, pigmentos, etc. , para realizar la producción industrial de productos vegetales.
Ya en 1964, mi país comenzó a cultivar células de ginseng. Después de la década de 1980, los investigadores científicos chinos han llevado a cabo una gran cantidad de cultivos celulares e investigaciones en plantas como Lithospermum spp., Panax notoginseng, tejo, Artemisia annua, Rhodiola rosea alpina, medusa campanilla blanca y otras plantas, y han utilizado biorreactores para realizar pequeñas -Estudios a escala sobre plantas medicinales. Cultivo celular a gran escala y a escala piloto. Entre ellos, la escala piloto de Xinjiang Lithospermum ha alcanzado los 100 litros, y Shikonin se produce en pequeñas cantidades y se utiliza para desarrollar cosméticos y medicamentos antibacterianos, antivirales y antitumorales. El cultivo celular a gran escala de tejo chino también ha logrado resultados iniciales. Del cultivo celular se ha obtenido el valioso fármaco anticancerígeno paclitaxel, pero es necesario mejorar el rendimiento.
⑶Aplicación de la tecnología haploide
El mejoramiento de haploides y la investigación relacionada se han utilizado ampliamente en plantas agrícolas y hortícolas. Blakeslee et al. (1922) y Kostoff (1941) obtuvieron respectivamente plantas haploides, lo que fue beneficioso para la detección de mutaciones y la detección de líneas celulares resistentes y acortó en gran medida el tiempo de reproducción. Además, los haplotipos desempeñan un papel importante en el mapeo genético y los estudios de transferencia genética.
Los haplotipos naturales son raros y están restringidos a unas pocas especies de plantas. El cultivo de anteras es una forma importante de formar haploides. Desde el primer cultivo exitoso de anteras en 1964, se han logrado avances significativos en la tecnología del cultivo de anteras, especialmente en cultivos como arroz, trigo y maíz. Las variedades de árboles frutales actualmente más exitosas incluyen principalmente anchoveta (Nair et al., 1983), papaya (Litz y Conover, 1978), cuatro variedades de cítricos (Chen, 1985), longan (Tang y Wei, 1984) y longan. 1983), manzanas (Zhang et al., 1990), peras (Jordan, 1975), uvas (Rajasekharan, 1979), etc. Xue Guangrong et al. (1980) indujeron con éxito plantas haploides cultivando polen haploide de fresa oriental (tetraploide).
El cultivo de anteras se ve afectado principalmente por el genotipo, la etapa de desarrollo de las anteras, el pretratamiento y las condiciones de cultivo. El principal problema es que la frecuencia de inducción haploide es baja y es difícil distinguir entre diploide formado por duplicación espontánea de haploides y diploide formado por tejido somático.
Por ejemplo, Fowler et al. (1971), Nishiyama Rei et al. (1974) y Rosati et al. (1975) utilizaron las anteras de fresa octoploide como materiales para inducir callos y diferenciar plantas, y encontraron que las plantas regeneradas todavía estaban. ocho veces más grande. El cuerpo se desarrolla a partir de órganos asexuales.
Además del cultivo de anteras, los óvulos vegetales, las células auxiliares, las células antípodas y otras células haploides se pueden diferenciar en embriones haploides o callos mediante cultivo in vitro. Se han hecho muchos intentos de cultivar óvulos y ovarios, pero en la mayoría de los casos, el crecimiento se detiene en la etapa de callo.
(4) Cultivo de embriones
El cultivo de embriones in vitro es la primera tecnología de cultivo de tejidos aplicada directamente a la mejora de plantas. El cultivo de embriones puede superar la disminución de embriones después de la hibridación, garantizar el éxito de la hibridación intraespecífica o interespecífica o utilizarse para cultivar plantas con reproducción asexual difícil. El cultivo de embriones también puede superar la latencia y el aborto de las semillas. Magdalita et al. (1996) y Drew et al. (1997) realizaron una hibridación interespecífica en papaya para obtener embriones adecuados y luego cultivaron los embriones para promover una hibridación exitosa. Jordan (1992) obtuvo callos pero no plantas regeneradas.
El Centro Internacional de Investigación de Tecnología Agrícola de Australia cultivó con éxito embriones híbridos entre papaya y sus especies silvestres, y obtuvo descendencia híbrida que se han heredado rasgos excelentes de las especies silvestres, como la resistencia y el alto contenido de azúcar. El lichi es uno de los árboles frutales difíciles de cultivar in vitro. Kantharajah et al. (1992) cultivaron embriones inmaduros de lichi con una longitud de 3 mm. Otras especies de árboles regeneradas mediante cultivo de embriones inmaduros incluyen aguacate, anchoa y papaya. Yao Qiang (1990) cultivó embriones jóvenes de melocotón, nectarina y flor de melocotón durante 60 días para obtener plantas regeneradas. J.Button et al. (1975) obtuvieron plantas completas mediante cultivo in vitro de callos embriogénicos de naranja dulce.
⑸Cultivo de protoplastos e hibridación de células somáticas.
Los protoplastos son células individuales a las que se les han eliminado las paredes celulares y son las unidades más pequeñas que pueden regenerar plantas completas in vitro. Cada protoplasto contiene toda la información genética de un individuo y, en condiciones de cultivo adecuadas, tiene la totipotencia para regenerar individuos similares a sus padres. El objetivo principal del cultivo de protoplastos es superar los obstáculos de la hibridación a distancia mediante la fusión de protoplastos, lograr la hibridación de células somáticas y producir descendencia híbrida. Durante el proceso de cultivo de protoplastos, a menudo ocurren una gran cantidad de mutaciones, de las cuales se pueden seleccionar excelentes mutantes. Los protoplastos pueden absorber diversos materiales genéticos macromoleculares, como orgánulos extraños, virus y ADN, lo que los convierte en una herramienta ideal para la transformación genética. Además, una gran cantidad de protoplastos obtenidos al mismo tiempo son genéticamente homogéneos y pueden establecer un buen sistema experimental para disciplinas biológicas como la biología celular, la biología del desarrollo, la fisiología celular y la citogenética.
Lizz (1986) aisló protoplastos de papaya y Krikorian et al. (1988) aislaron protoplastos de plátano, pero ninguno de ellos obtuvo células que continuaran dividiéndose. Nyman et al. (1987, 1988) informaron por primera vez sobre el cultivo de protoplastos y la regeneración de plantas de las variedades de fresa Sengana y Canaga. En 1992 obtuvieron plantas regeneradas a partir de protoplastos de hojas jóvenes y pecíolos de plántulas de fresa in vitro. Infante et al. aislaron protoplastos de las hojas y pecíolos de plántulas del sistema vegetativo alpino de fresa forestal in vitro y obtuvieron plantas regeneradas. Los callos y las células en suspensión son materiales importantes para la preparación de protoplastos, pero sólo unas pocas especies de árboles han aislado con éxito protoplastos de callos o células en suspensión de árboles frutales de hoja caduca, entre los cuales la especie arbórea de mayor éxito es el kiwi. Cai Qigui et al. (1988) aislaron protoplastos de callos de kiwi chinos y obtuvieron plantas regeneradas. Kovalenko et al. (1990) y Ochatt et al. (1988) utilizaron líneas celulares en suspensión para aislar protoplastos de cereza Colt y uva europea, respectivamente, para obtener plantas regeneradas.
Lin et al. (1997) aislaron protoplastos de callos embriogénicos y obtuvieron plantas regeneradas. Yi Qianjun et al. (1997) también aislaron protoplastos de cítricos (Hongjiang Citrus) de callos embriogénicos y obtuvieron plantas regeneradas. Sin embargo, el aislamiento de protoplastos del mesófilo no tuvo éxito. Ma et al. (1998) aislaron y cultivaron protoplastos de albaricoque de Alpinia.
En condiciones adecuadas, los protoplastos del albaricoque tardan entre 4 y 5 días en deformarse y comenzar a dividirse por primera vez en 5 a 6 días. Se pueden formar pequeños grupos de células de 15 a 20 células en aproximadamente 20 días, y se pueden formar microcallos después de 60 días. Después del subcultivo, el tejido del callo puede inducir brotes y raíces adventicias para formar una planta completa. Ding Aiping et al. (1994) estudiaron el cultivo de protoplastos de manzana y la regeneración de plantas. Se aislaron protoplastos de la línea celular en suspensión establecida en callos embriogénicos para obtener plantas regeneradas.
Después de eliminar la pared celular, las células vegetales pueden fusionarse entre sí como en la fertilización, y pueden realizar la recombinación de material genético entre padres incompatibles en la hibridación convencional, abriendo así un nuevo campo de hibridación de células somáticas. La hibridación somática se ha utilizado ampliamente en el fitomejoramiento y ha conducido a avances significativos en la esterilidad masculina citoplasmática y la resistencia a enfermedades. Al mismo tiempo, también se obtuvieron plantas híbridas somáticas con valor económico en frutales leñosos.
En la actualidad, los sistemas de fusión más eficaces incluyen el método de PEG con pH alto/Ca2 y el método de fusión por electroporación.
La primera hibridación somática se consiguió mediante la fusión de protoplastos de tomate y patata. La tecnología de fusión de protoplastos se ha utilizado ampliamente en la hibridación interespecífica de cítricos. Ohgawary fusionó los protoplastos de naranja dulce y dragón volador para obtener plantas híbridas somáticas.
El académico estadounidense Grosser fusionó los protoplastos de células del cultivo en suspensión de naranja dulce con los protoplastos del callo del pariente lejano Eupatorium adenophorum para obtener una planta híbrida somática alotetraploide. S.distcha tiene excelentes características como resistencia a enfermedades, resistencia al frío y tolerancia a la sal, lo que lo hace adecuado como portainjerto de cítricos.
[6]Transformación
El rápido desarrollo de la biología molecular ha llevado a una nueva revolución en la ciencia vegetal. Después de años de exploración, la gente tiene un profundo conocimiento de la biología y la genética a nivel molecular. Combinadas con técnicas de cultivo de tejidos, las técnicas de biología molecular se han aplicado a la modificación y alteración de genomas de plantas.
Debido a la identidad del código genético, genes útiles de cualquier organismo (como virus, hongos e insectos) pueden transferirse a las plantas. La introducción de genes (como genes resistentes a insectos o a enfermedades) conduce a la aparición de nuevos genotipos o a la mejora de genotipos, lo que permite la selección de genotipos resistentes a insectos o a enfermedades.
Los genes diana que se han aislado o aplicado hasta ahora incluyen principalmente genes de resistencia a enfermedades y plagas de insectos, genes de resistencia al estrés abiótico, genes para mejorar el rendimiento y la calidad de los cultivos, y genes para cambiar otras plantas. rasgos.
Existen muchos métodos para introducir genes extraños en células vegetales, como el método mediado por plásmidos de Agrobacterium (incluidos los plásmidos Ti y Ri), el método mediado por vectores de virus vegetales y el método de introducción directa de ADN (incluido PEG). -método mediado químicamente (incluidos métodos de transformación directa de ADN, como inducción, mediada por liposomas, estimulación eléctrica, ultrasonido, microinyección, microhaz láser, bombardeo de partículas y otros métodos de transformación directa de ADN inducidos físicamente) y métodos de transformación de genes mediados por sistemas de germoplasma. método de introducción del tubo polínico, método de inmersión de células germinales, etc.). En la actualidad, los métodos más utilizados y eficaces son el método mediado por Agrobacterium tumefaciens y el método de pistola genética. Desde la primera transformación exitosa mediada por Agrobacterium en tabaco y papa en 1983, se han transformado aproximadamente 120 plantas mediante este método. Los métodos mediados por Agrobacterium son muy eficaces para las dicotiledóneas, pero también se utilizan para las monocotiledóneas. El método de la pistola genética se puede utilizar tanto como callos como como células receptoras en suspensión, y es muy eficaz para monocotiledóneas.
2. Aplicación de la ingeniería celular en animales.
(1) Propagación rápida de variedades finas en peligro de extinción y nuevas variedades.
La gestación transabdominal mejora la utilización del ganado reproductor. En la década de 1930 se trasplantaron con éxito embriones de ovejas y cabras. En 1982, investigadores estadounidenses obtuvieron la primera vaca probeta del mundo. Se puede lograr una reproducción rápida mediante la fertilización in vitro, la tecnología de transferencia nuclear, la segmentación y fusión de embriones y otras tecnologías, y también se pueden crear nuevas variedades, como vacas lecheras de alto rendimiento y cerdos magros. Animales raros como los pandas gigantes y los tigres siberianos se cultivan mediante ingeniería de embriones y tecnología de clonación.
⑵ Utilizar cultivos de células animales para producir productos activos y fármacos.
Principales vacunas, anticuerpos, etc. En 1975, la Universidad de Cambridge, en el Reino Unido, utilizó por primera vez la tecnología de fusión de células animales para obtener anticuerpos monoclonales. Se han utilizado tanques de cultivo de 300 L y 1000 L para producir anticuerpos monoclonales y vacunas contra la mielitis gris, respectivamente.
En la década de 1990 surgió a nivel internacional una especie de "terapia con células vivas" que utilizaba células vivas como agentes terapéuticos. Principalmente multiplicaba y expandía las células autólogas del paciente in vitro o las inyectaba en el cuerpo. Este método tiene potenciales efectos terapéuticos sobre el cáncer, la leucemia, la diabetes, las quemaduras, el SIDA, etc.
(3) Ingeniería de tejidos para reparación o trasplante de órganos médicos
Utilizando tecnología de ingeniería celular, se puede reproducir in vitro una pequeña cantidad de células normales de órganos humanos residuales, obteniendo así órganos del paciente. Sitios de trasplante. Órganos con las mismas funciones requeridas y sin rechazo. Por ejemplo, en el laboratorio se cultivan algunos huesos, cartílagos, vasos sanguíneos y piel, y en el laboratorio se cultivan y dan forma a hígados, páncreas, corazones, senos, dedos y orejas.
(4) Biorreactor para animales transgénicos.
En comparación con el cultivo tradicional de células animales, la tecnología farmacéutica de animales transgénicos tiene grandes beneficios. Los animales transgénicos son fábricas farmacéuticas genéticas naturales. En 1992, el Instituto de Genética Médica de Shanghai crió la primera vaca transgénica de probeta del país que portaba un gen de proteína humana. En el año 2000, mi país crió cabras transgénicas portadoras del gen alfa antitripsina humana. De la leche de las cabras transgénicas se pueden extraer medicamentos específicos para el tratamiento del enfisema crónico, quistes de fibrosis pulmonar congénita y otras enfermedades.
3. Aplicación de la ingeniería celular en la protección energética y medioambiental.
Para obtener una cepa que pueda descomponer y utilizar el hidrolizado de celulosa y producir etanol de manera eficiente, se fusionaron Candida con una fuerte capacidad de utilización de celobiosa y Saccharomyces cerevisiae con una alta producción de etanol. La fusión obtenida no sólo utiliza celobiosa como única fuente de carbono sino que también tiene una mayor capacidad de producción de etanol que su matriz.
Al fusionar cuatro cepas de Streptomyces viridans TTA y Streptomyces xikang 75viz, su capacidad para degradar la celulosa de la paja de maíz aumentó entre un 155 y un 264 % en comparación con la cepa original.
Mediante electrofusión, Saccharomyces cerevisiae y Candida guillermoii se fusionaron para detectar cepas que pueden producir etanol utilizando xilosa y celobiosa, utilizando y reduciendo la contaminación ambiental de celulosa.