1) Detección de PS (fosfatidilserina) en la membrana celular externa: la transferencia de PS desde el interior al exterior de la membrana celular se produce poco después de que las células son inducidas a sufrir apoptosis, y puede servir como marca de reconocimiento. del sistema inmunológico. La anexina V, una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de calcio, puede unirse específicamente al PS expuesto en el exterior de la membrana y luego detectarlo mediante un sistema colorimétrico o luminiscente simple. Dado que se trata de una detección de apoptosis en células vivas en etapa temprana (aplicable tanto a células en suspensión como a células adherentes), se puede combinar con tintes de ADN u otros métodos de detección tardía para marcar las etapas de desarrollo de la apoptosis.
Las famosas empresas estadounidenses de reactivos biológicos CLONTECH e Invitrogen han desarrollado una variedad de productos etiquetados con Anexina V, que son simples y rápidos, y la detección se puede completar en 10 minutos. Entre ellos, la anexina V-EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) y la anexina V-FITC marcadas con fluorescencia tienen una alta sensibilidad y pueden usarse como base para la detección de células apoptóticas mediante el método FACS (clasificación de células de flujo). Debido a la proteína de fusión Anexina V-EGFP, la relación de unión de EGFP a PS es 1:1 y también se puede realizar una detección cuantitativa. Además, también se proporciona anexina V conjugada con biotina, que puede detectarse mediante reacciones cromogénicas ligadas a enzimas de uso común. Además, MACS Company recubre perlas magnéticas con anexina V y se pueden utilizar métodos de separación magnética para detectar células apoptóticas.
2) Detección de cambios en el estado redox intracelular:
Esto refleja una tendencia relativamente nueva en la investigación de la apoptosis, que estudia qué tipo de entorno redox provoca que se produzcan eventos posteriores. El kit de detección de glutatión ApoAlertTM de CLONTECH utiliza el tinte fluorescente monoclorobimano (MCB) para detectar la disminución del péptido glutatión en el citoplasma de las células apoptóticas in vitro para detectar cambios en el estado redox intracelular en las primeras etapas de la apoptosis. En condiciones normales, el glutatión (GSH) actúa como un importante tampón redox para las células. Los óxidos tóxicos en las células se eliminan regularmente al reducirlos con GSH, y el GSH oxidado puede reducirse rápidamente con la GSH reductasa. Esta reacción es particularmente importante en las mitocondrias, donde se eliminan muchos de los subproductos del daño oxidativo de la respiración. En Jurcat y algunos otros tipos de células, existe un sistema de transferencia de GSH dependiente de ATP en la membrana celular que puede iniciarse mediante señales apoptóticas. Cuando la eliminación de GSH intracelular es muy activa, el líquido celular cambia de un ambiente reductor a un ambiente oxidante, lo que puede conducir a una disminución del potencial de membrana mitocondrial de las células en las primeras etapas de la apoptosis, causando así el citocromo C (un importante componente en el ciclo del ácido tricarboxílico) a ) se transfiere desde las mitocondrias al líquido celular e inicia la reacción en cascada de la caspasa efectora de apoptosis.
Dado que el GSH está estrechamente relacionado con la función redox y mitocondrial, esta prueba no sólo es muy útil para estudiar el inicio de la apoptosis, sino que también puede usarse para investigaciones sobre el tratamiento de enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades. . Sin embargo, algunas células, como las células HeLa y 3T3, no presentan cambios evidentes en los niveles de GSH durante la apoptosis y no pueden detectarse con este método.
3) Detección de localización del citocromo C
El citocromo C, como sustancia señalizadora, juega un papel importante en la apoptosis celular. En circunstancias normales, existe en la cavidad entre las membranas interna y externa de las mitocondrias. Las señales apoptóticas estimulan su liberación de las mitocondrias al citosol. Después de unirse al Apaf-1 (factor activador de proteasa apoptótica-1), inicia la cascada de caspasas. Reacción: el complejo citocromo C/Apaf-1 activa la caspasa-9, que a su vez activa la caspasa-3 y otras caspasas posteriores. La subunidad IV de la citocromo c oxidasa (COX4) es una proteína de membrana ubicada en la membrana interna de las mitocondrias. Cuando se produce la apoptosis, se retiene en las mitocondrias, por lo que es una parte muy útil de la fracción enriquecida en mitocondrias.
El kit de fraccionamiento celular ApoAlertTM puede aislar rápida y eficazmente fracciones mitocondriales altamente enriquecidas de células apoptóticas y no apoptóticas sin ultracentrifugación, y luego etiquetar aún más las células con anticuerpos contra el citocromo C y anticuerpos COX4 mediante hibridación Western. del pigmento C y COX4 se utiliza para determinar la aparición de apoptosis.
4) Detección de cambios en el potencial de membrana mitocondrial:
En los primeros días de la investigación de la apoptosis, no había cambios obvios en las mitocondrias a partir de observaciones morfológicas. Con la investigación en profundidad sobre el mecanismo de la apoptosis, se ha descubierto que la apoptosis mitocondrial también es un componente importante de la apoptosis celular y que se producen muchos cambios fisiológicos y bioquímicos. Por ejemplo, el potencial transmembrana mitocondrial cambia después de la inducción de la apoptosis, lo que conduce a cambios en la permeabilidad de la membrana. MitoSensorTM, un tinte catiónico, es muy sensible a este cambio y exhibe tinciones fluorescentes diferentes. En las células normales, forma agregados en las mitocondrias y emite una fuerte fluorescencia roja. En las células apoptóticas, debido a cambios en el potencial transmembrana mitocondrial, existe en el citosol en forma de monómero y emite fluorescencia verde. Estas dos señales fluorescentes diferentes se pueden distinguir claramente mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. El kit de sensor de membrana mitocondrial ApoAlert de CLONTECH utiliza este principio para detectar cambios en el potencial de la membrana mitocondrial. Sin embargo, este método no puede distinguir cambios en el potencial de membrana mitocondrial causados por apoptosis u otras causas. En la etapa tardía de la apoptosis, las endonucleasas (sustratos de ciertas caspasas) escinden el ADN nuclear entre los nucleosomas, produciendo una gran cantidad de fragmentos de ADN con una longitud de 180 a 200 pb. Generalmente existen dos métodos para detectar este fenómeno:
1) TUNEL (marcaje de extremo de mella dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal)
Uso de la transferasa terminal de ADN para transferir el extremo de mella Etiquetado El dNTP marcado (principalmente dUTP) se conecta indirectamente (a través de digoxigenina) o directamente al extremo 3'-OH del fragmento de ADN, y los resultados se analizan cuantitativamente mediante el desarrollo de color ligado a enzimas o la detección de fluorescencia. La empresa estadounidense Intergen ofrece una variedad de métodos de marcaje, incluido el marcaje fluorescente directo, el marcaje fluorescente mediado por digoxigenina o el desarrollo cromogénico ligado a peroxidasa, que pueden usarse para suspensiones celulares, tejidos fijados con formalina o tratados con parafina, cultivos celulares, etc. Pruebas de una variedad de muestras. Entre ellos, el marcado directo tiene menos pasos y es fácil de operar. El etiquetado indirecto tiene la función de amplificar la señal y tiene una alta sensibilidad de detección.
2) Escalera LM-PCR (detección por PCR mediada por ligadura)
Cuando la proporción de células apoptóticas es pequeña y la cantidad de muestra de prueba es pequeña (como en una biopsia), Es posible que los cambios en el ADN nuclear no se observen directamente mediante electroforesis en agarosa. El kit de ensayo en escalera ApoAlert? LM-PCR de CLONTECH utiliza LM-PCR (PCR mediada por ligación) para conectar adaptadores específicos y amplificar específicamente fragmentos de gradiente de nucleosomas, detectando así de manera sensible las moléculas de ácido nucleico producidas durante la apoptosis. Además, el ensayo LM-PCR es semicuantitativo, por lo que se pueden comparar diferentes muestras con el mismo grado de apoptosis.
Los dos métodos anteriores se dirigen a la característica de la fragmentación del ADN nuclear en la última etapa de la apoptosis, pero este fenómeno también puede ocurrir cuando las células están sometidas a otros daños (como daños mecánicos, rayos ultravioleta, etc.). ), por lo que no son eficaces para la apoptosis celular. La detección se verá interferida por otros motivos.
3) Detección por Telemerasa
Este es un método relativamente temprano y ampliamente utilizado. La telomerasa es una proteína nuclear compuesta de ARN y proteína. Puede transcribir de forma inversa su propio ARN como plantilla para sintetizar secuencias repetidas teloméricas, "inmortalizando" las células. Las células somáticas normales no tienen actividad telomerasa. Cada vez que se dividen, los telómeros de los cromosomas se acortan. Esto puede servir como un reloj de mitosis, indicando la edad celular, la senescencia replicativa o la apoptosis. Los estudios han encontrado que más del 90% de las células cancerosas o apoptóticas tienen actividad telomerasa. El kit de detección de telemerasa TRAP-eze de Invitrogen se lanzó por primera vez en 1996.
Proporciona sustratos de oligonucleótidos específicos, cebadores emparejados con el sustrato y repeticiones teloméricas respectivamente. Si la muestra a analizar contiene actividad de telomerasa, se pueden conectar diferentes números de secuencias de repetición telomérica de 6 bases (GGTTAG) al sustrato mediante la reacción de PCR, se puede observar una diferencia de seis bases mediante la detección de electroforesis del producto. ver Figura 4). Además, Intergen también proporciona kits para la detección mediante inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA).
Del mismo modo, este método de detección no es específico para la apoptosis y los resultados de la detección no reflejan puramente la apoptosis. Sobre la base de las características morfológicas inherentes de las células apoptóticas, se han diseñado muchos métodos diferentes de detección de la morfología de la apoptosis.
1. Microscopio óptico y microscopio invertido
1. Células no teñidas: el tamaño de las células apoptóticas se vuelve más pequeño y deformado, la membrana celular está intacta pero se produce espuma y se pueden observar cuerpos apoptóticos en la etapa tardía de la apoptosis.
Las células adherentes se encogen, se redondean y se caen.
2. Células teñidas: se utilizan habitualmente tinción de Giemsa, tinción de Wright, etc. Las células apoptóticas tienen morfologías apoptóticas típicas, como condensación y marginación de la cromatina, escisión de la membrana nuclear y segmentación de la cromatina en bloques y cuerpos apoptóticos.
2. La microscopía de fluorescencia y la microscopía de barrido láser enfocada generalmente utilizan cambios morfológicos en la cromatina nuclear como indicadores para evaluar el progreso de la apoptosis celular.
Los colorantes específicos de ADN de uso común incluyen: HO 33342 (Hoechst 33342), HO 33258 (Hoechst 33258) y DAPI. La unión de los tres tintes al ADN no está incrustada y se une principalmente a la región de la base AT del ADN. Emite una fluorescencia azul brillante cuando se excita con luz ultravioleta.
Hoechst es un tinte reactivo que se une específicamente al ADN. La solución de almacenamiento se prepara con agua destilada a una concentración de 1 mg/ml. Cuando se usa, se diluye con PBS hasta una concentración final de 2%. 5 mg/ml.
DAPI es semipermeable y se utiliza para la tinción rutinaria de células fijadas. La solución de almacenamiento se prepara con agua destilada hasta una concentración de 1 mg/ml y la concentración final es generalmente de 0,5 ~ 1 mg/ml.
Evaluación de resultados: Los cambios morfológicos de la cromatina nuclear durante el proceso de apoptosis se dividen en tres etapas: en la etapa I, el núcleo se ondula o arruga y aparece algo de cromatina en estado condensado; el núcleo de las células de fase IIa está muy condensado y marginado; el núcleo de las células de fase IIb se rompe en fragmentos y se producen cuerpos apoptóticos.
3． Observación con microscopio electrónico de transmisión
Evaluación del resultado: El tamaño de las células apoptóticas se reduce y el citoplasma se concentra. En la fase I de la apoptosis (núcleos de proapoptosis), la cromatina en el núcleo está muy enrollada y aparecen muchas estructuras de vacuolas llamadas cavitaciones; en la fase IIa, la cromatina en el núcleo está muy condensada y marginada en la etapa tardía; En la apoptosis, el núcleo celular se rompe en fragmentos y se producen cuerpos apoptóticos. La apoptosis juega un papel importante en el desarrollo embrionario, la hematopoyesis, la maduración del sistema inmunológico, el mantenimiento de la estabilidad celular y el equilibrio del crecimiento en tejidos y órganos normales, e incluso en el envejecimiento del cuerpo. Por tanto, la investigación sobre la apoptosis se ha llevado a cabo ampliamente en diversos campos clínicos y básicos, y el método de detección de células apoptóticas es muy importante. La citometría de flujo (FCM) integra tecnología de chorro de fluido, tecnología óptica láser, tecnología electrónica y tecnología informática. Tiene ventajas incomparables sobre otros métodos. Puede usarse tanto cualitativa como cuantitativamente, y es simple, rápida y sensible y puede realizar múltiples. -análisis de parámetros y células vivas. La investigación sobre APO se ha utilizado ampliamente y ha abierto nuevas vías.
1 Método de dispersión de luz
En el sistema FCM, cuando las células a probar pasan por el área de medición del instrumento en el flujo de líquido, son irradiadas por láser y se mueven en todas las direcciones del ángulo sólido de 360° en el espacio. La luz dispersada, de la cual la intensidad de la luz dispersada hacia adelante (FSC) está relacionada con el tamaño de la celda, mientras que la intensidad de la luz dispersada lateral (SSC) está relacionada con el índice de refracción de. la membrana plasmática y el interior de la célula. Durante la apoptosis, las células se encogen, se vuelven más pequeñas, sufren fragmentación nuclear y los gránulos intracelulares tienden a aumentar, por lo que el FSC de las células apoptóticas disminuye y el SSC aumenta. La necrosis celular produce hinchazón del cuerpo celular y fragmentación y descomposición del núcleo celular, por lo que tanto el FSC como el SCC aumentan. Las células normales tienen FSC alto y SSC bajo.
La principal ventaja de detectar células apoptóticas basándose en las propiedades de dispersión de la luz es que las propiedades de dispersión de la luz se pueden combinar con el análisis de inmunofluorescencia de la superficie celular para distinguir e identificar subtipos de linfocitos que sufren apoptosis selectiva después de estos tratamientos especiales. clasificación. Vale la pena señalar que la confiabilidad de juzgar las células apoptóticas basándose en FSC y SSC se ve muy afectada por la uniformidad de la morfología celular medida y la relación núcleo-citoplasma. Por lo tanto, en algunas apoptosis de linfocitos, las características de dispersión de la luz se utilizan para detectar la apoptosis. Tiene buena confiabilidad en la apoptosis pero poca confiabilidad en la apoptosis de células tumorales.
2 Determinación del contenido de ADN celular
Durante la apoptosis celular, la endonucleasa se activa, lo que lleva a la fragmentación del ADN. Esta es una manifestación característica de la apoptosis y también proporciona la base para que FCM identifique la apoptosis. Las células sientan las bases. Entre los métodos para detectar la fragmentación del ADN en células apoptóticas, el más utilizado y el más sencillo es el análisis del contenido del ADN celular. Cuando las células se tratan con etanol y TritionX-100, aparecen agujeros en la membrana celular y se liberan pequeños fragmentos de ADN de las células, lo que hace que su contenido de ADN sea menor que el de las células normales. Después del análisis con tinción con yoduro de propidio (PI), puede aparecer un pico "subdiploide" antes del pico diploide C0/G1, es decir, el pico de apoptosis (pico de APO) se puede medir en función del porcentaje de células APO. , este método es simple y fácil de realizar, puede detectar cuantitativamente muestras de apoptosis en grandes cantidades y también puede analizar la posición de las células en el ciclo celular al mismo tiempo. Además, el método FCM se puede utilizar para identificar células en la fase G0 mediante la detección conjunta de ADN y ARN. Por tanto, se puede analizar la relación entre la apoptosis y la aterosclerosis G1 o G0. El grado de degradación del ADN depende de la etapa de la apoptosis, el tipo de célula y la identidad de los factores inductores de la apoptosis. Los cambios en el escape del ADN durante el proceso de tinción también afectan los resultados de la detección de FCM. Según la investigación, agregar una alta concentración de tampón fosfato-citrato a la solución de enjuague puede aumentar el escape de ADN degradado, mejorando así la capacidad de distinguir las células apoptóticas de las células normales.
La limitación del ensayo de contenido de ADN en la detección de apoptosis es que su especificidad y sensibilidad no son altas. La especificidad no es alta porque el pico de APO representa un grupo de poblaciones de células, incluidas células apoptóticas, células dañadas mecánicamente, células con bajo contenido de ADN o células con diferentes estructuras cromosómicas. En los casos anteriores, la cantidad de ADN unido al tinte fluorescente. es pequeño. Además, cuando las células no fijadas se disuelven en una solución hipotónica, puede aparecer una gran cantidad de fragmentos nucleares. En este momento, el número de células en el pico de APO solo representa el número de fragmentos nucleares y no el número de. células apoptóticas. La razón de la baja sensibilidad es que solo aparecen puntos de ruptura del ADN en la etapa temprana de la apoptosis, pero aún no se ha producido una gran pérdida de fragmentos de ADN, por lo que este método no puede detectar células apoptóticas tempranas ni células apoptóticas que ocurren en la fase S o G2/M. fase, debido a que su contenido real no es menor que el ADN contenido en las células diploides, este método debe combinarse con otros métodos morfológicos o bioquímicos al analizar células apoptóticas, para analizar con mayor precisión el estado apoptótico de las células.
Método de tinción con naranja de acridina (AO) 3Y
El AO puede teñir ADN bicatenario y ADN desnaturalizado en células o núcleos con diferentes colores de fluorescencia. Cuando el AO se inserta en el ADN bicatenario, emite fluorescencia verde; el AO también puede interactuar con el ADN monocatenario o el ADN monocatenario producido por desnaturalización y luego emite fluorescencia roja. Por lo tanto, al detectar diferentes fluorescencias mediante FCM, el grado. se puede determinar la apoptosis. Una vez estandarizado el ensayo, la cantidad de intensidad de fluorescencia verde y roja es proporcional al contenido total de ADN, y la relación entre fluorescencia roja y fluorescencia celular total (rojo más verde) representa la proporción de ADN desnaturalizado en la célula. El método se puede utilizar para evaluar la sensibilidad a la desnaturalización in situ. A veces, la degradación del ADN de las células apoptóticas no es obvia, y los métodos que se basan en la degradación del ADN para detectar la apoptosis celular, como la medición del contenido del ADN celular, el etiquetado de los extremos del ADN, etc., son difíciles de detectar cambios apoptóticos. El principio de detección de apoptosis mediante el método AO no depende de la generación de fragmentos de ADN, por lo que su principal ventaja es que puede aplicarse a situaciones como el desequilibrio entre fragmentos de oligonucleosomas y la apoptosis. Sin embargo, la tinción con AO no puede distinguir eficazmente las células mitóticas y la apoptosis. Células muertas.
4 Método de tinción con rodamina (Rh123)
Bajo las condiciones de vida de las células, los efectos de las bombas de sodio-potasio y las bombas de calcio en la membrana celular mantienen diferentes iones dentro y fuera de la célula. membrana El gradiente de concentración, que incluye Na + , K + , Cl - , Ca2 + , etc., forma el potencial de membrana celular. FCM puede detectar la distribución de tintes fluorescentes iónicos lipófilos dentro y fuera de la membrana celular para medir el potencial de membrana y evaluar la viabilidad celular. Rh123 es un tinte fluorescente catiónico lipófilo que es permeable a las membranas celulares y es particularmente sensible a las membranas mitocondriales. Cuando las células están vivas, la rodamina 123 atraviesa la membrana celular y se acumula en las mitocondrias para emitir fluorescencia verde. Durante la apoptosis celular, la capacidad de transporte de la membrana mitocondrial disminuye y la electronegatividad disminuye, por lo que también se pierde la capacidad de las mitocondrias celulares para acumular Rh123 y, en consecuencia, disminuye la intensidad de la fluorescencia, se detectan los cambios apoptóticos de las células. . Sin embargo, cabe señalar que en las primeras etapas de la apoptosis, debido a que la membrana celular aún está intacta y la mayoría de los orgánulos y funciones celulares son relativamente buenos, el método Rh123 es más difícil de identificar células apoptóticas tempranas y células viables.
5 Tecnología de etiquetado final in situ
Durante la apoptosis celular, la fragmentación del ADN precede a los cambios morfológicos y la reducción del contenido de ADN (ISEL) es un método que penetrará en la apoptosis exógena. Los nucleótidos en las células se combinan con las roturas monocatenarias o bicatenarias producidas por las células apoptóticas debido a la activación de nucleasas endógenas bajo la catálisis de enzimas y ADN, y son más sensibles que los aspectos antes mencionados. Por lo general, existen dos métodos: ① ADN polimerasa I o traducción de mella de unidad mediada por fragmentos grandes de Klenow (INST); ② Marcado de extremo de mella dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL).
INST utiliza la ADN polimerasa para integrar nucleótidos en el extremo 3' del ADN roto en células apoptóticas, y al mismo tiempo hidroliza el extremo 5' para reparar el ADN. Si se utilizan nucleótidos marcados, células con. Se puede mostrar ADN roto. En 1993, Gorczyca et al. propusieron el método de marcaje de la transferasa del ácido desoxirribonucleico terminal (TdT) para detectar la fragmentación del ADN en células apoptóticas. Debido a la activación de la endonucleasa endógena, la cromatina o el ADN de la propia célula se corta y genera la misma cantidad de extremos 3'2 hidroxilo que los puntos de ruptura del ADN pueden marcar dUTP biotinilado al extremo 3'2 hidroxilo, a través de la avidina 2FITC. En el sistema, se produce fluorescencia específica en el sitio del punto de ruptura del ADN para identificar células apoptóticas. El método de etiquetado final con TdT es un método relativamente específico para identificar células apoptóticas. Hay muy pocas células apoptóticas en el tejido cerebral, por lo que se necesitan técnicas de detección más sensibles para fragmentos de ADN genómico. La combinación del método TUNEL con FCM puede mejorar la sensibilidad de la detección de fragmentos de ADN en células apoptóticas. Después de que las células fueron tratadas con factores inductores de apoptosis durante un cierto período de tiempo, la apoptosis marcada en el extremo in situ fue mayor que la mostrada por la tinción Hoechst33342, lo que sugiere que TUNEL puede detectar núcleos que aún no han mostrado características morfológicas obvias de apoptosis pero que tienen sometido a escisión del ADN, lo que permite mejorar la sensibilidad de la detección. Los estudios comparativos han demostrado que la sensibilidad de TUNEL es mucho mayor que la de ISNT. Especialmente en la etapa inicial de APO, la tasa positiva del método TUNEL es mayor. Esta puede ser la razón por la cual la mayor parte del ADN se rompe al mismo tiempo en ambos dobles. hebras cuando se produce APO, y las hebras individuales son raras. Este último se basa en la reacción de reparación mediada por la ADN polimerasa, por lo que la tasa positiva de ISNT es relativamente baja. TUNEL también se puede combinar con el análisis simultáneo de células para comprender simultáneamente la relación entre la fragmentación del ADN y la distribución del ciclo celular de las células apoptóticas. Recientemente, se ha convertido en uno de los métodos más utilizados para identificar y cuantificar células apoptóticas. Sin embargo, debido a que el proceso de etiquetado del ADN roto es complejo e involucra muchos factores, el resultado negativo del etiquetado final no representa necesariamente la integridad de la cadena de ADN. Problemas metodológicos, como la pérdida de la actividad de la enzima TdT y muchos otros factores influyentes. debe descartarse. Por lo tanto, al aplicar el método de etiquetado terminal TdT para identificar células apoptóticas, se deben configurar grupos de control tanto positivos como negativos para obtener resultados confiables.
Método 6Anexina V/PI
En 1992, Fadok informó que la fosfatidilserina (PS) ubicada en el interior de la membrana celular migra al exterior de la célula en la etapa temprana de APO. Este fenómeno aparece en la tinción nuclear antes de la degeneración cualitativa y la reducción del tamaño nuclear.
La anexinaV es una proteína vascular con fuertes propiedades anticoagulantes y tiene una alta afinidad con los fosfolípidos, especialmente con los fosfolípidos cargados negativamente como la PS. Sus propiedades pueden usarse para detectar la apoptosis celular. Sin embargo, las células necróticas PS también están expuestas a la superficie y son positivas para la unión de Anexina V. Por lo tanto, la Anexina V no se puede usar para distinguir necrosis o apoptosis, y se debe usar PI para distinguir las células necróticas. FCM expone PS en la membrana celular a través de la etiqueta Anexina V-FITC, se combina con PI, ingresa a la membrana celular dañada para marcar y degradar el ADN y analiza células apoptóticas y necróticas. Hay 4 subpoblaciones durante la detección que incluyen células dañadas mecánicamente (Anexina - / P1 +), células normales (An2nexina - / PI -), células apoptóticas (Anexina + / PI -) y células necróticas secundarias (Anexina + / PI +) que se diferencian. . Boersma et al. utilizaron la tinción con Ampexin V2FITE para detectar cambios de apoptosis en células de hámster chino después del tratamiento con fármacos citotóxicos y encontraron dos subpoblaciones de células con diferentes intensidades de señal de fluorescencia. Una morfología adicional confirmó que la subpoblación de células de fluorescencia débil representa células apoptóticas tempranas, y la subpoblación de fluorescencia fuerte representa células apoptóticas tardías. Se puede ver que este es un método relativamente confiable para detectar y cuantificar células apoptóticas. Durante la apoptosis celular, la PS en la membrana queda expuesta antes que la fragmentación del ADN, por lo que este método es más sensible para detectar la apoptosis temprana, y este método no requiere la fijación de las células, evitando el exceso de desechos celulares causados por la fijación por el método PI y la fijación por El método TUNEL Los fragmentos de ADN que aparecen se pierden, por lo que ahorra más tiempo y los resultados son más fiables. Actualmente es el método de detección cuantitativa de apoptosis más ideal.
7 Otros
7.1 Método del anticuerpo monoclonal ssDNA El uso de anticuerpos monoclonales anti-ADN monocatenario (ssDNA) para la detección de apoptosis fue un descubrimiento accidental, ya que en la aplicación de ADNss En la detección de daños en el ADN inducidos por fármacos citotóxicos utilizando anticuerpos monoclonales (método de fluorescencia), se observó que las células de leucemia apoptótica (MOL T24) tenían una fuerte fluorescencia. Posteriormente, después de las mejoras adecuadas, se demostró que los anticuerpos monoclonales de ADNss pueden identificar específicamente apoptosis. células. En comparación con el método TUNEL, el ssDNA tiene mayor sensibilidad. Las células apoptóticas detectadas mediante el método TUNEL pueden ser sólo un subtipo de las células apoptóticas detectadas mediante el método de anticuerpos monoclonales. El método ssDNA se utiliza generalmente para detectar APO mediante inmunofluorescencia. Pero también se puede utilizar junto con FCM. El método del anticuerpo monoclonal es fácil de usar, de bajo costo y ampliamente utilizado. Los anticuerpos monoclonales de ADNss pueden distinguir entre necrosis y apoptosis, e incluso pueden detectar apoptosis temprana, necrosis postapoptótica y algunas formas especiales de apoptosis (como la apoptosis no fragmentada). Por lo tanto, se espera que el método del anticuerpo monoclonal ssDNA se convierta en un nuevo método específico y sensible para detectar la apoptosis.
7.2 El análisis de las proteínas relacionadas con la apoptosis encontró que muchos genes participan en la regulación de la apoptosis. Estos productos genéticos pueden participar en la promoción o inhibición de la aparición y el desarrollo de APO. Por lo tanto, es necesario detectar proteínas genéticas que regulan la apoptosis. importante para la investigación. APO y su regulación juegan un papel importante. Hasta el momento se han podido analizar los productos proteicos de un gran número de genes reguladores de la apoptosis, como la proteína P53, caspasas, C2myc, antígeno Fas, TNF, proteínas de la familia bcl22, ciclina, ras, etc. FCM tiñe con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia contra varias proteínas reguladoras, recopila señales de fluorescencia de diferentes longitudes de onda y detecta la cantidad de moléculas fluorescentes en la superficie de la membrana celular o dentro de las células. Puede comprender los cambios en cada célula y requiere menos muestras. El método es sencillo, rápido y preciso.
8 Outlook
En los últimos años, con el desarrollo continuo de la tecnología FCM y la profundización gradual de la investigación de APO, FCM se ha utilizado cada vez más en la investigación de la apoptosis. La aplicación de FCM para detectar cuantitativamente células apoptóticas es simple, rápida y objetiva, y puede llevar a cabo una detección multiparamétrica. Por lo tanto, la APO y su expresión oncogénica relacionada, la distribución del ciclo celular y muchos otros factores se pueden analizar simultáneamente, y más. -Se puede obtener una comprensión profunda del mecanismo regulador de la muerte.
Aunque existen muchos métodos para estudiar la apoptosis celular utilizando FCM, el método de detección de células apoptóticas mediante FCM generalmente se basa en ciertas características como la morfología y la bioquímica durante la apoptosis, lo que dificulta la comprensión de los diversos cambios que ocurren durante el proceso de apoptosis. La relación mutua también hace que este tipo de método carezca de especificidad. Por lo tanto, la aplicación combinada de una variedad de métodos de detección de FCM dirigidos a diferentes características puede identificar de manera más efectiva las células apoptóticas. Al mismo tiempo, los resultados de la investigación sobre FCM deben combinarse con observaciones morfológicas o métodos bioquímicos para obtener una comprensión más profunda de las características biológicas de las células apoptóticas. Con el desarrollo de la biotecnología y la comprensión profunda de la naturaleza de la APO por parte de la gente, creo que en un futuro próximo estarán disponibles métodos más específicos y sensibles que ayudarán a lograr avances en la apoptosis.