1. Solución de teñido de violeta cristal: 20 ml de solución saturada de etanol de violeta cristal (2 g de violeta de cristal disueltos en 20 ml de etanol al 95%) y 80 ml de solución acuosa de oxalato de amonio al 1%. Líquidos uniformemente durante 24 horas y luego filtrar.
2. Solución de safranina: 2,5 g de safranina O (safranina, también conocida como safranina O), 100 ml de etanol al 95% después de disolverse, se puede almacenar en una botella marrón sellada cuando se use. 20 ml y 80 ml de agua destilada. Simplemente mezcle.
La tinción de cristal violeta y la tinción de safranina son los dos reactivos principales de la tinción de Gram. La tinción de Gram no solo se utiliza para observar la morfología de las bacterias, sino que también es un método importante para la identificación de bacterias, ya que puede distinguirlas. todas las bacterias en dos categorías: bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.
Información ampliada:
1. Los pasos de la tinción de Gram son:
Unción→fijación→tinción púrpura cristal→lavado con agua→mordiente de yodo→Lavar con agua → decolorar con alcohol → contrateñir con safranina → lavar con agua → secar → observar.
2. Determinación del número de células mediante el método de tinción con violeta cristal
1 Añadir 0,1 ml de 5 × 104 a 10 × 4 células WEHI-164 a cada pocillo de un recipiente de 96 pocillos. placa de cultivo celular líquido (medio de cultivo RPMI-1640 que contiene 10% de suero de ternera) y cultivarlo en una incubadora de dióxido de carbono a 37°C con 5% de CO2 durante 2 a 3 horas para permitir que las células se adhieran a la pared.
2. Utilice el medio de cultivo RPMI-1640 para diluir el estándar de TNF 10 veces en serie, diluya la muestra a analizar de 3 a 5 veces en serie según sea necesario y agregue 0,1 ml del estándar o muestra diluida. para ser probado en cada pocillo, 3 pocillos replicados para cada dilución.
Hay 6 pocillos de control, se añaden 0,1 ml de medio de cultivo RPMI-1640 que contiene 4 μg de TNF a cada uno de los 3 pocillos de control positivo y se añaden 100 μl de medio de cultivo RPMI-1640 a cada uno de los 3 pocillos de control negativo. Continúe cultivando durante 18 a 24 horas.
3. Sacuda el medio de cultivo, lave cuidadosamente una vez con PBS, agregue 0,1 ml de solución de metanol al 10 % a cada pocillo para fijar las células durante 30 segundos.
4. Aspire la solución de metanol, agregue 0,1 ml de solución de tinte violeta cristal a cada pocillo y déjela a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5. Sacuda suavemente la solución de tinción, lave cada pocillo con agua destilada y coloque la placa de cultivo boca abajo sobre papel absorbente para absorber el agua. Secar de forma natural o secar en secadora a 37 ℃. Esta placa se puede almacenar a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo.
6. Antes de la medición, agregue 0,1 ml de ácido acético al 33 % a cada pocillo para la decoloración, agite bien y mida la absorbancia de la luz a 570 nm. Utilice el valor de absorbancia óptica (OD) para trazar la dilución de la muestra y compare la curva estándar y la curva de la muestra que se va a analizar para obtener la actividad de las citoquinas en la muestra que se va a analizar
Referencia: Baidu Encyclopedia-Safranin
Referencia: Enciclopedia Baidu: tinte violeta cristal