2. Interrupción del ADN de la muestra: muestras como ADN genómico o BAC se interrumpen en fragmentos de 300 ~ 800 BP; para ARN pequeños no codificantes, este paso no es necesario. Los productos de PCR cortos se pueden amplificar con cebadores de fusión GS y luego pasar directamente al paso 4.
3. Ligación: Conectar los adaptadores A y B con especificidad en los extremos 3' y 5' a los fragmentos de ADN mediante una serie de técnicas estándar de biología molecular. Los adaptadores también se utilizarán en pasos posteriores de purificación, amplificación y secuenciación. Sólo se muestran los fragmentos de ADN monocatenario utilizados en los siguientes pasos.
4. Un fragmento de ADN = una perla magnética: el adaptador combina cientos de fragmentos de ADN en una perla magnética. Después de que las perlas magnéticas se recubren con una única gota de mezcla de aceite y agua, se amplifican de forma independiente. droplet. , no afectado por otras secuencias competidoras o contaminantes, logrando así la amplificación paralela de todos los fragmentos de ADN (emPCR).
5. Una perla magnética = una longitud de lectura: después de la amplificación emPCR, el fragmento de ADN de cada perla magnética tiene miles de copias idénticas. Después del enriquecimiento, estos fragmentos permanecen unidos a las perlas magnéticas y luego pueden colocarse en una placa de microtitulación para su posterior secuenciación.
6. Herramientas de lectura y análisis de datos: FLX GS
Este sistema proporciona tres herramientas bioinformáticas diferentes para analizar datos de secuenciación, adecuadas para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, resecuenciación de secuencias de hasta 3Gb, análisis de diferencias entre productos amplificados y secuencias de referencia conocidas, secuenciación de novo de 120Mb, etc.
El sistema de secuenciación Roche 454 es el primer sistema de secuenciación de próxima generación y los resultados de su aplicación se han publicado en numerosos artículos en Nature and Science. El sistema 454 se ha actualizado muchas veces desde su lanzamiento. El último analizador de secuencia GS FLX combinado con reactivos de secuenciación de la serie Titanium tiene un mayor rendimiento de secuenciación (400 Mb por reacción), mayor flexibilidad y precisión, manteniendo la velocidad de funcionamiento más rápida de la tecnología de secuenciación de próxima generación (3-5 días) y único. Con la ventaja de la longitud de lectura de secuencia más alta (400 pb), la precisión de una sola longitud de lectura puede exceder el 99,5 y la precisión constante de los resultados de la secuenciación completa es superior al 99,5. Como nuevo miembro de la serie Titanium, el kit de extremo emparejado de larga distancia puede realizar secuenciación de extremo emparejado de inserciones de 3 a 20 kb, rompiendo el cuello de botella de secuencias repetitivas deficientes en la tecnología de secuenciación de próxima generación. Además, tener un paquete de software completo es una característica importante de GS FLX. Su interfaz gráfica simple y fácil de usar se puede utilizar para dibujar, empalmar y detectar diferencias en productos amplificados. Al mismo tiempo, debido a su longitud de lectura de secuenciación ultraalta, GS FLX se puede integrar con el software de análisis de secuencia tradicional, lo que también es imposible con otras tecnologías de secuenciación de próxima generación. Debido a su excelente rendimiento, el sistema GS FLX puede usarse ampliamente en investigaciones genómicas, como la secuenciación de novo del genoma completo y la resecuenciación de la biblioteca BAC, la resecuenciación de productos de amplificación, el análisis del transcriptoma y la regulación genética.