Este artículo es una traducción del método de prueba de endotoxinas bacterianas USP24, pero el estándar actual es el segundo suplemento USP-NF 19. Los lectores pueden aprender de él y ver las deficiencias del método de prueba de endotoxinas bacterianas USP24. Este artículo presentará el método de uso del reactivo de Limulus para detectar la concentración de endotoxinas bacterianas en o sobre muestras. Los amebocitos de Limulus (LAL) se derivan de células circulantes de lisados de amebocitos de Limulus, que se extraen, preparan y detectan en agua y luego se utilizan en el método de coagulación.
El punto final de la reacción se obtiene mediante comparación directa de la muestra diluida con un estándar de endotoxina de referencia diluido en paralelo. El contenido de endotoxina medido se expresa en unidades de endotoxina prescritas.
Los datos del reactivo LAL también se leen mediante métodos de turbidez o cromogénicos, y estas pruebas se pueden utilizar siempre que cumplan con los requisitos de estos métodos seleccionados. Al realizar experimentos, primero debe crear una curva estándar y usar esta curva para calcular el contenido de endotoxinas de la muestra a analizar, incluido el tiempo de incubación de la muestra y la solución de control después de agregar el reactivo de Limulus, y la longitud de onda utilizada para leer el óptico. densidad en el espectrofotómetro. Estos deben ser estipulados de antemano. Para la turbidimetría de punto final, las lecturas deben tomarse inmediatamente después del período de incubación. En los ensayos cinéticos (nefelometría y métodos cromogénicos), la densidad óptica se mide durante todo el período de reacción y el porcentaje utilizado para calcular el resultado se calcula a partir de estas lecturas. En la detección colorimétrica de punto final, una vez alcanzado el tiempo de reacción predeterminado, se agrega un reactivo que finaliza la reacción enzimática para detener la reacción y luego se leen los datos.
1. Estándar de endotoxina de referencia y estándar de endotoxina de control
La endotoxina estándar de referencia (RSE) es el estándar de referencia para endotoxina en la USP y su potencia es de 10 000 unidades de endotoxina USP (UE). por botella. De acuerdo con el estándar de endotoxina, agregue 5 ml de agua reactiva LAL a cada botella, revuelva intermitentemente con un agitador giratorio durante 30 minutos para disolver y prepare una solución madre. Esta solución madre luego se usa para diluciones en serie apropiadas. La solución original debe almacenarse en el refrigerador para su futura dilución, pero el tiempo de almacenamiento no debe exceder los 14 días. Revuelva vigorosamente con un mezclador rotatorio durante al menos 3 minutos antes de usar, diluya cada paso durante al menos 30 segundos y luego úselo para diluir el siguiente paso. La endotoxina de referencia diluida no debe almacenarse para su uso posterior porque la adsorción la desactivará. La endotoxina estándar de control (CSE) se prepara por separado del estándar de endotoxina de referencia. Se debe probar un nuevo lote de estándares de control de endotoxinas antes de su uso. El reactivo de lisado utilizado en la verificación debe ser el mismo lote de reactivo de lisado utilizado en la prueba. Cuando se hace referencia a estándares de endotoxinas y se compara con estándares de endotoxinas, el método de aglutinación del reactivo de lisado se puede utilizar y realizar de acuerdo con la "Operación de prueba". Para cada lote, se comparó al menos 1 botella con 1 botella que sirve como estándar de endotoxina de referencia. Haga 4 tubos de ensayo para cada dilución del estándar de endotoxina de referencia. La dilución estándar de control de endotoxinas también debe ser de 4 tubos por frasco o muestra. El recíproco de la diferencia entre el Log10 medio del criterio de valoración del estándar de endotoxina de referencia y el Log10 medio del criterio de valoración del estándar de endotoxina de control es igual al valor de calibración del título del estándar de endotoxina de control. Dependiendo de la situación, se puede convertir al número de unidades por ng de preparación seca o al número de unidades contenidas en cada botella.
El título de un estándar de endotoxina de control adecuado no debe ser inferior a 2 UE/ng ni superior a 50 UE/ng.
2. Preparación para el examen
Se debe confirmar la sensibilidad del lisado. Todos los recipientes y utensilios utilizados para los experimentos deben calentarse en un horno a ≥250°C durante un tiempo suficiente para destruir las endotoxinas exógenas que puedan estar presentes en las superficies de estos utensilios.
Para determinar si los resultados de la prueba de endotoxinas son confiables, se deben tomar o extraer muestras de varios utensilios, soluciones y suministros de lavado utilizados en la prueba, y se deben usar métodos apropiados para demostrar que no tienen propiedades inhibidoras. , estiramiento u otros efectos de interferencia en la reacción. Las pruebas de inhibición o pruebas de mejora se pueden llevar a cabo según los siguientes métodos. Se debe establecer un control negativo en la prueba. Si se cambian las materias primas, los métodos de producción o la prescripción del reactivo LAL, se debe volver a realizar la prueba.
3. Prueba de confirmación de la sensibilidad del reactivo de Limulus
Para confirmar la sensibilidad en la etiqueta del reactivo de Limulus, se debe tomar al menos 1 botella de muestra de cada lote para su verificación. De acuerdo con el estándar de endotoxina (o el estándar de control de endotoxina), realice una dilución en serie de 2 veces a 2,0 λ, 1,0 λ, 0,5 λ y 0,25 λ... donde λ es la sensibilidad UE/ml en la etiqueta del reactivo de Limulus.
Repita 4 tubos de ensayo para las 4 diluciones anteriores y los materiales de control negativo. El logaritmo de la media geométrica de los resultados obtenidos debe ser mayor o igual a 0,5λ y menor o igual a 2,0λ.
La sensibilidad de la etiqueta debe confirmarse antes de utilizar cada nuevo lote de reactivo LAL.
4. Prueba de inhibición y prueba de mejora
No añadir endotoxina a muestras que no puedan detectarse mediante una dilución eficaz, de modo que la concentración final sea igual a 2,0λ, 1,0λ, 0,5. λ y 0,25 λ. De acuerdo con las disposiciones de los procedimientos de inspección, utilice endotoxinas estándar para la verificación. Prepare al menos 4 tubos de muestra libres de endotoxinas y que contengan endotoxinas. Al mismo tiempo, diluya dos tubos de endotoxina y control negativo con agua para realizar una prueba en tubos paralelos. De acuerdo con el método de cálculo y juicio, calcule la media geométrica de la concentración de endotoxina final de la muestra.
Si el resultado es mayor o igual a 0,5λ y menor o igual a 2,0λ, la muestra es adecuada para el examen de endotoxinas bacterianas.
Las pruebas de supresión y mejora pueden repetirse después de la neutralización, inactivación o eliminación de sustancias que interfieren o dilución de la muestra hasta la dilución máxima eficaz. Los efectos inhibidores y potenciadores de dosis conocidas de endotoxina pueden superarse si se utiliza una dilución máxima eficaz. Luego, la muestra se puede diluir y analizar en busca de endotoxinas.
Si hay endotoxina endógena presente en muestras no tratadas en condiciones experimentales. Las muestras no son adecuadas para pruebas de inhibición o resistencia a la tracción. Sin embargo, la endotoxina en esta muestra puede eliminarse mediante ultrafiltración o diluirse adecuadamente para que sea adecuada para ensayos de inhibición o mejora. Diluya las muestras no tratadas (por ejemplo, abra los frascos antes de usarlas o dilúyalas antes de la inyección) hasta que la endotoxina ya no sea detectable, pero no exceda el factor de dilución efectivo máximo. Nuevamente, estas muestras diluidas se usaron para ensayos de inhibición o mejora.
5. Dilución máxima efectiva
La dilución máxima efectiva se refiere a la concentración a la que se disuelve o diluye un fármaco para inyección u otro uso no oral únicamente. A veces esto se hace para evitar calcular el volumen de la dosis (UE/ml). El factor MVD se puede obtener dividiendo la concentración límite en la etiqueta del reactivo por la sensibilidad (UE/ml) λ. Si la concentración límite del agente se calcula por peso o unidad activa del fármaco (UE/mg o UE/unidad). El factor MVD es el factor de dilución limitante que se utiliza para preparar una prueba y hacerla válida.
6. Ejecución de prueba
Durante el proceso de preparación y prueba, se debe tener cuidado de evitar contaminar la muestra con una gran cantidad de bacterias. Para detectar cuantitativamente el contenido de endotoxinas en una muestra, a menudo se utiliza un método de dilución en serie para diluir la muestra. Utilice el método de dilución geométrica para que cada dilución del paso anterior sea proporcional al siguiente paso. En la prueba deben incluirse controles de producto negativos, positivos y positivos.
El paso de dilución en serie debe repetirse para al menos 2 tubos de ensayo por cada muestra a analizar. Las diluciones seriadas de endotoxinas estándar deben incluir al menos dos tubos replicados. Cada tubo del marco debe tener una serie de tubos de dilución para endotoxinas estándar. Siempre que las condiciones ambientales de cada bastidor sean consistentes, un bastidor puede estar compuesto por varios bastidores de prueba.
(1) Preparación: La forma y la cantidad de endotoxina estándar y reactivo de lisado varían de un fabricante a otro. Por tanto, la disolución y dilución debe realizarse según las instrucciones de la etiqueta. A menos que se especifique lo contrario, el pH de la muestra y la mezcla de reactivo LAL debe estar entre 6,0 y 8,0. Antes de la prueba, el valor del pH de la muestra se puede ajustar agregando hidróxido de sodio estéril, ácido clorhídrico o un tampón adecuado para evitar la contaminación por endotoxinas.
(2) Funcionamiento: Coger varios tubos de ensayo de 10mm×75mm o un solo tubo de ensayo. Agregue cantidades adecuadas de controles negativos, endotoxinas estándar, muestras y controles positivos de producto a cada tubo de ensayo. Para controlar los productos positivos, agregue endotoxina estándar a una concentración de 2,0 λ al reactivo LAL, solución de lavado o extracto y colóquelo en el centro. Registre con precisión el tiempo de colocación del tubo de ensayo, colóquelo a 37 ℃ -65438 ± 0 ℃ durante 60 min ± 2 min y luego retírelo suavemente para observarlo. Si se forma un gel firme, gírelo 180 grados. Si se queda, es positivo y está marcado con (+). Si no se forma gel o el gel formado no es fuerte, se considera negativo y se marca con (-). Tenga cuidado al sacar los tubos de ensayo para evitar colisiones innecesarias y resultados falsos negativos. La prueba se considera inválida si el control positivo del producto es negativo, o la concentración del estándar de endotoxina diluido con el doble de la sensibilidad indicada en la etiqueta del reactivo LAL no está dentro del rango de 1, o cualquiera de los controles negativos es positivo. Luego se calcula el contenido de endotoxinas en la muestra.
7. Cálculo y juicio
(1) Cálculo de la media geométrica: El tubo positivo en el punto final de la dilución en serie es el punto final de la muestra o muestra más el tubo de endotoxina. .
Registre la concentración final e de cada tubo, conviértala en una concentración final logarítmica e y use la siguiente fórmula para calcular la concentración media geométrica de la concentración final:
La concentración media geométrica del punto final = log-1(∑e/f )
donde ∑e es la suma de los puntos finales logarítmicos para cada dilución; f es el amperio del tubo replicado para cada dilución;
(2) Cálculo del contenido de endotoxinas: al calcular el contenido de endotoxinas (UE/ml, UE/g o UE/mg) en o sobre el producto de prueba, primero calcule la concentración final e y luego multiplique Utilice el factor de dilución λ (λ es la sensibilidad indicada en la etiqueta del reactivo LAL). La concentración media geométrica de la muestra analizada es igual al recíproco de Σe/f, donde e es igual al logaritmo de la concentración final y f es el número de tubos replicados de la dilución de la muestra analizada.
(3) Juicio de resultado: si el contenido de endotoxinas es inferior al límite de contenido especificado por la variedad, la variedad cumple los requisitos.