¿Cuáles son los principales tipos, características y métodos de control de la contaminación en cultivo de tejidos?
La contaminación en cultivo de tejidos es principalmente contaminación bacteriana y contaminación fúngica. Las principales características de la contaminación bacteriana son la turbidez y los rastros turbios en el medio de cultivo en las proximidades del material. Generalmente se puede encontrar 1 o 2 días después de la vacunación. La característica de la contaminación por hongos es que en el frasco de cultivo suelen aparecer trozos de micelio blancos, negros o verdes de diferentes colores. Por lo general, se encuentra dentro de 3 a 10 días. En términos de control, no es más que exigir estrictas condiciones asépticas y operaciones asépticas durante el proceso de cultivo de tejidos. En términos generales, la contaminación del cultivo de tejidos se debe a las siguientes razones: 1. Esterilización incompleta del medio de cultivo. 2. Desinfección incompleta de explantes. 3. La operación de vacunación no estuvo estandarizada y el equipo de vacunación no fue desinfectado completamente. 4. El ambiente de cultivo no está limpio, etc. Por lo tanto, si prestas atención a los puntos anteriores, deberías poder mejorarlo. En el cultivo de tejidos vegetales, ¿cuáles son las principales formas de contaminación microbiana y cómo prevenir la contaminación en el cultivo de tejidos vegetales?
Las principales medidas para prevenir la contaminación son:
(1) Mejorar el medio ambiente condiciones. La sala de inoculación y la sala de cultivo deben desinfectarse y purificarse periódicamente, y la luz ultravioleta debe estar encendida en el banco de trabajo o en la caja de inoculación durante más de 30 minutos antes de la inoculación. La humedad relativa de la sala de cultivo debe controlarse en aproximadamente el 70%. Si la humedad relativa es demasiado alta, se puede utilizar un deshumidificador para deshumidificarla.
(2) La formación de los vacunadores es fundamental. Las operaciones asépticas deben realizarse estrictamente. Las herramientas necesarias para la vacunación deben esterilizarse estrictamente antes de su uso. En el área de operación del banco de trabajo ultralimpio, no coloque demasiado material a utilizar para evitar bloquear el flujo de aire. También se debe comprobar periódicamente la calidad del trabajo del banco de trabajo ultralimpio [8].
(3) Revisar estrictamente el material de vacunación. Eliminar materiales de inóculo contaminados con hongos y bacterias.
(4) Compruebe con frecuencia la calidad de esterilización del esterilizador y repárelo inmediatamente si encuentra algún problema. Una vez que el manómetro del esterilizador cae a cero, no se puede descargar inmediatamente. Debido al efecto de presión negativa causado por la acción del aire frío y caliente, el aire frío del ambiente externo es absorbido nuevamente hacia la botella de cultivo esterilizada, lo que provoca que Para evitar este fenómeno, después de la desinfección, la botella de cultivo debe retirarse del recipiente después de que se haya enfriado ligeramente [9].
(5) Compruebe si hay algún problema con el contenedor de cultivo. Los recipientes de cultivo suelen estar sellados con tapas de plástico, tapones de goma, tapones de algodón, películas, etc. Las tapas de plástico son propensas a envejecer después de un uso prolongado, tienen malas propiedades de sellado y también pueden causar contaminación. Lin Sheng et al. prepararon un "desinfectante número 4" para desinfectar la boca de los frascos de cultivo, que puede controlar la tasa de contaminación del medio de cultivo por debajo del 0,3% [10].
3 Prevención y control de la contaminación en subcultivo
Los materiales estériles obtenidos en la etapa inicial son teóricamente estériles, pero la contaminación también puede ocurrir en las etapas posteriores o durante el subcultivo. Los materiales de subcultivo que transportan bacterias accidentalmente también pueden estar contaminados por hongos propagados por ácaros en la sala de cultivo. Este tipo de contaminación se puede prevenir desde dos aspectos: (1) Deben existir procedimientos razonables al ampliar la reproducción. Una vez obtenido el cultivo estéril inicial, una parte del mismo debe almacenarse como "calidad" y propagarse en lotes y volver a analizarse antes de proporcionarlo para la producción a gran escala. (2) Se puede prevenir agregando agentes antibacterianos al medio de cultivo [3]. Xu Wanfang et al. utilizaron carbendazim para inhibir bacterias y promover el crecimiento en cultivos de tejidos de Anomatis. El efecto fue significativamente mejor que el de metalaxil, tiofanato de metilo y mezclas de Anoectochilus cultivadas en un medio que contenía carbendazim, que no se contaminaron con microorganismos. la tasa llega a 100, no hay plántulas albinas y las plántulas están sanas [11].
Para las bacterias endofíticas en las plantas, debido a que se esconden más profundamente y no pueden eliminarse mediante métodos de desinfección de superficies, a veces en el cultivo inicial de explantes, incluido el subcultivo de generaciones anteriores, a menudo no es fácil de detectar. a simple vista en el medio de cultivo A medida que aumenta el número de pases, la carga bacteriana se acumula y desarrolla gradualmente, y luego se vuelve visible en el medio de cultivo [12]. Huang Xiaorong y otros creen que la causa de la contaminación bacteriana en el cultivo de tejidos vegetales es el resultado de la germinación de esporas bacterianas latentes [13]. La contaminación por endófitos, como las bacterias, se puede prevenir y reducir añadiendo antibióticos al medio de cultivo, cultivando las puntas de los brotes y reduciendo el valor del pH.
Wang Yifei et al. agregaron 200 mg/L de penicilina GK cuando la colorida alocasia se multiplicó rápidamente hasta la cuarta y quinta generación, lo que pudo inhibir eficazmente el crecimiento de endófitos sin afectar el coeficiente de reproducción [14].
Zhai Jianzhong descubrió que en el cultivo de tejidos de Catharanthus roseus, la estreptomicina era más eficaz que la gentamicina y la cefazolina sódica para inhibir la bacteria endofítica Xanthomonas sp. El uso simultáneo de dos antibióticos en el medio de cultivo fue beneficioso para la prevención y el control de la resistencia bacteriana a los medicamentos. controlar el desarrollo de la contaminación bacteriana durante un período de tiempo más largo, pero aumentar la dosis de estreptomicina causará toxicidad en las plantas [15].
A la hora de añadir nuevos agentes antibacterianos al medio de cultivo, es muy importante elegir la concentración adecuada. Una concentración baja tendrá poco efecto, mientras que una concentración alta envenenará fácilmente las plantas, afectando la proliferación o provocando la muerte. materiales cultivados se vuelvan negros y causen la muerte Plántulas, plántulas albinas, etc. La combinación de dos o más antibióticos puede prevenir la resistencia bacteriana. Los antibióticos y el carbendazim generalmente no son resistentes a las altas temperaturas y requieren esterilización por filtración, lo cual es muy inconveniente de agregar durante la producción. Sin embargo, el benzoato de sodio, el sorbato de potasio, el propionato de sodio, etc. se usan comúnmente como conservantes en los alimentos y pueden soportar altas temperaturas y. Presiones. , es más conveniente usarlo en la producción de cultivos de tejidos.
Los endófitos en los materiales vegetales también se pueden eliminar mediante cultivos repetidos de las puntas de los brotes. Debido a que las bacterias patógenas se distribuyen de manera desigual en las plantas y se propagan a través de haces vasculares, el meristemo de la punta del brote no es bacteriano. Tanto las bacterias endofíticas como los virus se pueden eliminar mediante cultivos repetidos de la punta del brote.
A excepción de Erwinia spp., la mayoría de las bacterias no pueden crecer cuando el pH del medio es inferior a 4,5. En el cultivo de tejidos de plantas de Aster, Iris y Rosa, ajustar el valor del pH del medio de cultivo de 5,8 a 3,9 a 4,3 puede evitar una gran cantidad de contaminación bacteriana [7]. Hu Qing et al. utilizaron hidroponía con un valor de PH bajo (3,10) y mejoraron las condiciones de ventilación del contenedor, lo que puede provocar la proliferación normal de grupos gigantes verdes con una contaminación bacteriana grave, que es inofensiva para el crecimiento de las plantas individuales. Las plántulas que pueden echar raíces son más altas que las del cultivo sólido convencional, lo que básicamente resuelve el problema de que aún se puedan producir bacterias después de una contaminación bacteriana severa [16].
Para los cultivos contaminados, a veces las plantas más grandes también se pueden cortar, reesterilizar e inocular porque los materiales vegetales son difíciles de conseguir o la reaparición requiere mucho tiempo. Li Chunyan et al. utilizaron 4 millones o 6 millones de unidades/L de solución acuosa estéril de penicilina para remojar plántulas contaminadas con bacterias del cultivo de tejidos de álamo durante 60 minutos o 40 minutos respectivamente, lo que puede prevenir eficazmente la contaminación bacteriana en el cultivo de tejidos. Cuando las plántulas tratadas se subcultivan, la contaminación bacteriana ya no vuelve a ocurrir y las plántulas tienen una fuerte capacidad de diferenciación. Cuando se enraizan y se cultivan, el sistema de raíces se desarrolla y la tasa de supervivencia del trasplante es alta [17]. La investigación experimental de Li Ying et al. ha demostrado que si solo hay contaminación por hongos en el subcultivo, se puede remojar en una solución estéril de 3 carbendazim durante más de 0,5 horas, enjuagar con agua esterilizada y luego inocular, o inocular directamente sin agua esterilizada. enjuague Eliminar la contaminación por hongos. Si hay contaminación bacteriana y contaminación simultánea por bacterias y hongos, se puede utilizar el método de desinfección HgCl2 para cortar las plántulas cultivadas contaminadas en segmentos de tallo más largos como explantes, enjuagarlos con agua del grifo durante 0,5 horas y luego colocarlos en un banco de trabajo limpio. Se puede restablecer un sistema de cultivo de vacunas estéril utilizando etanol y HgCl2 durante un corto período de tiempo [18].
4 Reducir los componentes orgánicos en el medio de cultivo
La presencia de materia orgánica en el medio de cultivo es una causa importante de contaminación, y eliminar la materia orgánica también es una forma de reducir la contaminación. En el cultivo de tejidos de pistachos, Song Fenghui et al. eliminaron VB1, VB6, niacina y otros componentes orgánicos (que retienen mioinositol) en el medio de cultivo, después de 2 a 3 generaciones de cultivo, podrían inhibir el crecimiento bacteriano. y proliferación de yemas en racimo. Sin impacto. La razón es que se trata de sustancias esenciales para el crecimiento de determinadas bacterias. Después de eliminar estas sustancias orgánicas, las bacterias no pueden crecer ni desarrollarse, y poco a poco mueren y disminuyen [19]. La tecnología de propagación rápida del cultivo de tejidos sin azúcar de plantas, iniciada por el profesor Toyoki Furuzai de Japón, elimina por completo los componentes orgánicos del medio de cultivo, introduce una cantidad controlable de gas CO2 como fuente de carbono y promueve la fotosíntesis de las plantas mediante el control de los factores ambientales. cambia de heterótrofo a autótrofo, por lo que las plantas crecen bien y la tasa de contaminación se reduce significativamente [20]. Debido a la eliminación del azúcar, el cultivo de plántulas de cultivo de tejidos se ha cambiado de botellas de vidrio a recipientes grandes tipo caja. También se puede utilizar toda la sala de cultivo como recipiente de cultivo, y ni siquiera se requiere una operación aséptica estricta. poca contaminación. Esta tecnología se utiliza al menos en muchos La etapa de promoción de raíces de plántulas de cultivo de tejidos vegetales es muy exitosa.
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La eficacia bloqueadora del polvo de la mascarilla se debe a su capacidad para proteger contra el polvo fino. , especialmente partículas respiratorias por debajo de 2,5 micrones. La eficacia de barrera del polvo nocivo es el estándar. Debido a que el polvo de este tamaño de partículas puede ingresar directamente a los alvéolos, tendrá el mayor impacto en la salud humana. El principio de bloqueo del polvo de las mascarillas de gasa es la filtración mecánica, es decir, cuando el polvo golpea la gasa, pasa a través de capas de barreras para bloquear algunas partículas grandes de polvo en la gasa. Algo de polvo fino, especialmente el polvo de menos de 2,5 micrones, pasará a través de la malla de la gasa y entrará en el sistema respiratorio. Las máscaras antipolvo están hechas de material filtrante hecho de fieltro de fibra de carbón activado o tela no tejida. El polvo respirable de menos de 2,5 micrones pasa a través de este material filtrante. ¿Cuáles son los principales métodos de esterilización en el cultivo de tejidos?
1. El método de esterilización por calor húmedo aumenta la temperatura del vapor presurizando y esterilizando con vapor a alta presión. Tiene una fuerte penetración, alta temperatura y la mejor esterilización. Efecto. Notas: 1. Elimina completamente el aire frío en el autoclave. Cuando existe aire frío, el valor de temperatura alcanzado bajo la misma presión manométrica es menor, y cuanto menos aire frío se descargue, menor será la temperatura. -esterilización con vapor a presión, para garantizar que se alcance la temperatura especificada, el aire frío debe eliminarse por completo, de lo contrario, aunque se alcance la presión pero la temperatura no cumpla con los requisitos especificados, la esterilización no será completa 2. La esterilización ultravioleta tiene un amplio espectro, pero el poder de penetración es débil y hay muchos factores que influyen, por lo que la eficiencia de la esterilización está sujeta a ciertas limitaciones. El efecto de desinfección de los rayos ultravioleta está relacionado con factores como la intensidad ultravioleta, el tiempo de irradiación, la temperatura y. Humedad nuestro país estipula que la intensidad de irradiación de las lámparas ultravioleta a una distancia de 1 m no debe ser inferior a 70 μw/cm2. Generalmente, los rayos ultravioleta deben reemplazarse si la lámpara se utiliza durante más de 100 horas. reducirá el efecto de esterilización. La temperatura para la esterilización con lámpara UV es de 20 ~ 40 ℃ y la humedad relativa es de 40 ~ 60 3. Método de esterilización por calor seco y esterilización con llama: la quema se utiliza principalmente para esterilizar herramientas. puede lograr una esterilización completa. La esterilización por llama se usa generalmente en operaciones asépticas. Las bocas de los tubos de ensayo, las bocas de las botellas de vidrio, los tapones fluoroplásticos de silicona, etc. se pasan repetidamente a través de la llama, use la llama para esterilizar la boquilla y otros tubos para evitar la contaminación. de la boquilla como método de esterilización auxiliar durante la operación aséptica. 4 Esterilización por horneado en seco: use radiación térmica y aire caliente seco para la esterilización. Generalmente, se esterilizará después de inspeccionar los artículos para su esterilización, como productos de metal, vidrio y cerámica. , se pueden esterilizar mediante calor seco en el horno después del envasado. Generalmente se calientan a 160°C y se mantienen durante 2 horas, pero no deben exceder los 170°C, ya que las herramientas de medición de vidrio se deforman fácilmente. Enfriamiento La velocidad excesiva y el enfriamiento repentino pueden causar que la cristalería explote. Durante la esterilización por calor seco, los artículos colocados en el horno seco no deben estar apretados. Debe haber espacios para facilitar el flujo de aire caliente. Temperaturas desiguales y esterilización incompleta de algunos elementos. En el cultivo de tejidos vegetales, ¿cuáles son los factores que causan la contaminación de los materiales de cultivo de tejidos?
Esterilización incompleta de materiales
Esterilización incompleta de medios de cultivo
Esterilización de recipientes incompleta
Funcionamiento irregular
No sellar adecuadamente después de la inoculación Qué factores en el cultivo de tejidos vegetales pueden provocar contaminación
Causas de contaminación 1.1
Explante
①Edad, tipo y tamaño. Las plantas adultas contienen más bacterias; los materiales con edades fisiológicas mayores contienen más bacterias; los explantes con más bacterias diversas y endófitos, y las plantas con enfermedades y plagas de insectos son propensos a la contaminación, los materiales cultivados al aire libre contienen más bacterias en la superficie y bajo tierra; los órganos son susceptibles a la contaminación. Transportan más bacterias; los materiales con una superficie grande transportan más bacterias que los materiales con una superficie pequeña [1-2].
②La época y ubicación del material. Los hongos se multiplican vigorosamente en la temporada de lluvias y los materiales transportan más bacterias en esta época cuando el sol es más fuerte, los rayos ultravioleta son fuertes y tienen buenos efectos de esterilización, y los materiales transportan menos bacterias en esta época; crecen vigorosamente tienen más probabilidades de portar bacterias [1].
③Efecto de esterilización. La esterilización de explantes es la clave para el cultivo de tejidos. El efecto de esterilización determina directamente el éxito o el fracaso del cultivo de tejidos. Los métodos de esterilización y los agentes esterilizantes inadecuados provocan efectos de esterilización deficientes y hacen que los explantes porten bacterias. 1.2
El funcionamiento de cada eslabón técnico en el proceso de cultivo de tejidos no está estandarizado ①Medio.
El licor madre de bacterias largas se utiliza para preparar el medio de cultivo; el alto valor de pH de la base de cultivo y los componentes orgánicos recién agregados pueden provocar contaminación bacteriana, el medio de cultivo no se sella a tiempo después de ser envasado o no se esteriliza inmediatamente; después del sellado, la boca del recipiente de cultivo no está sellada herméticamente, lo que hace que las bacterias y las esporas de hongos vuelvan a ingresar al recipiente de cultivo después de la esterilización y contaminen el medio de cultivo y la cubierta de plástico y la película selladora utilizadas para sellar sean propensas a envejecer y agrietarse cuando se exponen; a la luz fluorescente durante mucho tiempo, lo que resulta en un sellado deficiente que puede provocar la contaminación del medio de cultivo. Las bandas de goma se aflojan y rompen fácilmente cuando se exponen a luces fluorescentes durante mucho tiempo, y varias bacterias pueden aprovechar la oportunidad para ingresar. el recipiente de cultivo; los métodos de esterilización inadecuados provocan la contaminación del medio de cultivo; el tiempo de esterilización es demasiado corto, lo que provoca una esterilización incompleta del medio de cultivo; abrir el recipiente de esterilización inmediatamente después de alcanzar el tiempo de esterilización provocará que la diferencia de presión en el recipiente aumente; ser demasiado grande, lo que hace posible que las bacterias externas sean absorbidas nuevamente hacia el recipiente [1] después de filtrar más soluciones, el efecto de filtración de la membrana del filtro será deficiente, de modo que después de la filtración la solución contiene bacterias y causa contaminación después de agregarla; el medio de cultivo.
② Recipientes de cultivo y equipos de inoculación. el recipiente de cultivo no está limpio; el recipiente de cultivo no está completamente esterilizado después de ser contaminado, lo que provoca contaminación cuando se reutiliza; el recipiente de cultivo y el equipo de inoculación en el autoclave u horno están demasiado llenos, lo que afecta el efecto de esterilización; Si el tiempo es demasiado corto, la esterilización será incompleta; si el autoclave o el horno se abren inmediatamente después de la esterilización, una fuerte convección de frío y calor hará que el aire frío sea aspirado hacia la capa del apósito y provoque contaminación y bacterias nuevamente [1].
③Personal de vacunación. Las uñas son demasiado largas; las manos no se lavan; la ropa y el cabello tienen mucho polvo y las zapatillas, la ropa de vacunación, los gorros y las máscaras no se cambian durante la vacunación. Los materiales de cultivo contaminados se llevan accidentalmente a la mesa de trabajo ultralimpia y se contaminan nuevamente; transferir hay demasiados cultivos inoculados en el recipiente de cultivo; demasiados objetos colocados en la mesa de trabajo ultralimpia y demasiado altos bloquearán el flujo de aire, lo que provocará un efecto de esterilización deficiente al hablar o toser se eliminará una gran cantidad de bacterias; ; las manos están fuera del alcance de trabajo durante la operación Encimeras; las manos tocan los bordes de los recipientes de cultivo y los colocan encima de los utensilios y equipos de inoculación, lo que provoca que los microorganismos caigan en los recipientes de cultivo y traigan polvo al abrir los tapones, o películas de sellado de contenedores de cultivo que se contaminaron con las manos o materiales portadores de bacterias durante el proceso de inoculación. No se desinfectó y el material se contaminó después de ser utilizado nuevamente, no se operó en la dirección del viento del banco de trabajo ultralimpio; los hongos cayeran al contenedor con el viento [3]; se continuó inoculando inmediatamente después de dejar la mesa de trabajo ultralimpia a mitad de camino, y la inoculación se llevó a la mesa de trabajo ultralimpia para continuar. inoculación, que trae polvo y es arrastrado hacia los recipientes por el viento. La ropa, los sombreros, las máscaras y las pantuflas se ensuciarán después de usarlos durante mucho tiempo y habrá mucho polvo en la superficie. Si se usan repetidamente sin limpiarlos, causarán contaminación.
④Sala de inoculación y sala de cultivo. La entrada y salida de personal provoca la presencia de una gran cantidad de bacterias y hongos en el aire de la sala de inoculación y sala de cultivo, especialmente la entrada y salida de personal que no es personal durante el diseño de la sala de inoculación; irrazonable, lo que genera exceso de polvo y bacterias en la habitación; la mesa de trabajo ultralimpia se coloca debajo de demasiado polvo. En muchos lugares, el dispositivo de filtrado falla debido al uso prolongado y al mantenimiento inadecuado de las puertas y ventanas de la sala de cultivo de tejidos; y la sala de inoculación no están bien cerradas, lo que permite que las moscas entren, lo que favorece la propagación de diversas bacterias. la sala de cultivo es grande y fácil de contaminar, y la temperatura interior y la humedad del aire son altas y la reproducción de hongos es grande y vigorosa. también agravará la contaminación
¿Qué factores en el cultivo de tejidos vegetales pueden provocar la aparición de contaminación? Cómo prevenir la contaminación 98
Editor de Contaminación (palabra china)
Contaminación, palabra china, se refiere a estar manchado de suciedad o sustancias nocivas o estar afectado por malos pensamientos.
El nombre chino contamina el nombre extranjero contamina Pinyin wū rǎn Pinyin ㄨㄖㄢˇ Sinónimos turbio, turbio, mancha Antónimos
1. [contaminar ser *** oreja; mancha]: hacer Contaminado con suciedad o sustancias nocivas
Contaminación radioactiva de toda el área
2. [contaminar]: Se refiere a ser afectado por malos pensamientos
La mente está contaminada
3. [*** oído involucrar]: se refiere a acusación o participación falsa [1] En el cultivo de tejidos vegetales, ¿qué factores pueden conducir a la contaminación?
1 Los explantes no son un tratamiento limpio provoca contaminación
En segundo lugar, las placas de Petri contaminadas no se manipulan adecuadamente, provocando una contaminación secundaria.
En tercer lugar, se contaminan herramientas como pinzas y bisturíes, el medio de cultivo. no está esterilizado y el banco de trabajo no está esterilizado Bacterias
4. No hay bacterias que caigan cerca de la boca de la botella de llama durante la inoculación, y la operación no calificada aumenta la tasa de contaminación
5. El experimentador habla y pelea, y el trabajo es intensivo
6. ¿Cuáles son los métodos de control de la contaminación del aire para la contaminación de laboratorio a gran escala y cuáles son sus características?
Contaminación del aire El control se puede dividir en eliminación de polvo atmosférico, eliminación de impurezas, desodorización, desinfección, etc.
La eliminación de polvo incluye eliminación de polvo con bolsas, precipitador electrostático, pulverización, etc.
La eliminación de impurezas es un desperdicio. tratamiento de gases, como la desulfuración, incluido el método húmedo, el método semiseco y el método seco
La desodorización implica procesos biológicos ¿Cuáles son los métodos para controlar la contaminación acústica de los automóviles, como la desodorización, la desodorización con filtros biológicos y la desodorización con carbón activado? ?
Parece que no hay forma de hacer esto. Depende del ángulo en el que te encuentres. Si estás en un automóvil, solo puedes cambiar el tubo de escape, pero el efecto puede no ser bueno.
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