Soluciones y reactivos
1,1 veces, solución salina tamponada con fosfato (PBS): 8 g de sodio clorado, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 Se disuelven gna2hpo4, 0,24 g de kh2po4 en 800 ml de agua destilada (dH2O). Ajustar el pH a 7,4 con HCl y 1 L. Conservar a temperatura ambiente.
2. Formaldehído (metanol libre)
3. Tampón de incubación: 0,5 g de albúmina sérica bovina (BSA) disueltos en 100 ml de 1XPBS. Conservar a 4°C.
bFijo
Centrifugar y aspirar el sobrenadante de 1. Recoge células.
Brevemente 0,5-1 ml de PBS. Añadir formaldehído 2. Finalmente las celdas fueron restauradas.
2-4% formaldehído.
10 minutos, 3. Fijado en 37 grados centígrados.
Sobre el hielo. Congele los tubos durante 1 minuto.
Ponche de carne
Agregue metanol 100% helado para precongelar lentamente las células y gire suavemente hasta una concentración final de 90% de metanol para eliminar el 90% de metanol utilizado en el solución anterior 1. Permeabilizar las células, centrifugar y resuspender las células del sedimento.
2. Déjalo reposar en hielo durante 30 minutos.
3. Continuar teñiendo o almacenar las células en metanol al 90% a 20°C.
La tinción se realizó utilizando anticuerpos primarios no marcados.
Nota: Se permite el emparejamiento de anticuerpos monoclonales del mismo tipo o el emparejamiento de especies controladas. Anticuerpos de anticuerpos. Las células se pueden contar clonalmente utilizando un hemocitómetro u otros métodos.
1. Alícuota de 0,5-1x106 en cada unidad de tubo (relación de volumen).
2. Añadir 2-3 ml de líquido centrífugo. Repita el enjuague para cada tubo de tampón de incubación.
En 100 μl de tampón de incubación, 3. Se detectaron células recuperadas en cada tubo.
Incubar con buffer durante 4 minutos. Bloquear a temperatura ambiente durante 10 minutos.
5. Agregue el anticuerpo primario en la dilución adecuada (consulte la hoja de datos de cada anticuerpo para conocer las diluciones adecuadas).
6. Incubar a temperatura ambiente durante 30-60 minutos.
Como amortiguador antes de la eclosión, 7. El líquido de enjuague se centrifuga.
8. Diluir las células recuperadas con anticuerpos secundarios conjugados * * * fluorescentes.
Incubar el buffer según las recomendaciones del fabricante.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Como tampón de preincubación, 10. El líquido de enjuague se centrifuga.
11. Analizar las células recuperadas mediante PBS y citometría de flujo de 0,5 ml.
*Recomendado por Invitrogen.
¿A-11070 Alexa para Flúor? El fragmento F(ab’)2 de IgG anti-conejo de cabra es 488 (alto + largo) (dilución 1:1000)
¿A-11017 Alexa de Flow Corporation? 488 (alto + largo) fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IgG de ratón (dilución 1:1000)