Jiang 1, Xin Aiguo 2,1.
(1. Escuela de Química e Ingeniería Ecológica, Universidad de Nacionalidades de Guangxi, Nanning, Guangxi 530006; 2. Laboratorio Abierto Clave de Virología Animal Tropical y Subtropical, Ministerio de Agricultura, Kunming, Yunnan 650225)
Resumen: Los virus microARN son virus de ARN de cadena positiva, y la estructura del genoma y el mecanismo de expresión génica de los virus pertenecientes a esta familia se conservan. Este artículo revisa la investigación sobre la regulación de la expresión genética de los picornavirus, incluido el inicio de la traducción independiente de la estructura de la tapa, el cierre de la traducción de la célula huésped, el procesamiento de poliproteínas virales y la replicación del ARN, con el fin de dilucidar la patogénesis y la verdad de la investigación de los picornavirus. Regulación de la expresión en organismos nucleares.
Palabras clave: picornavirus; expresión génica; sitio de entrada interno al ribosoma; elemento estructural del ARN
Basado en las diferencias en las características físicas de las partículas virales, la secuencia del ARN y la estructura del genoma, pequeños miembros de La familia de los virus ARN se puede dividir en siete géneros principales, a saber, enterovirus, rinovirus, cardiovirus, afthvirus, hepatovirus y diecovirus. Los representantes típicos de esta familia son el poliovirus (PV), el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la fiebre aftosa (FMDV) y el virus de la encefalomiocarditis (EMCV). Los genomas virales de microARN están compuestos por un ARN de cadena única positiva con una longitud de 7,0 kb a 8,5 kb. El extremo 5' del genoma está conectado a una pequeña proteína viral VPg y el extremo 3' tiene una cola poli(A). También hay dos regiones no traducidas (UTR) conservadas en ambos extremos del ARN genómico. En las primeras etapas de la infección viral, la VPg que ingresa a la célula con el ARN viral se escinde del ARN viral mediante proteasas celulares. La 5′UTR del ARN genómico de picornavirus es de 600 nt a 1300 nt y contiene el sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) necesario para el inicio de la traducción viral. La región codificante del genoma incluye regiones proteicas estructurales y regiones proteicas no estructurales, que se dividen en tres moléculas precursoras primarias (P1, P2 y P3). Entre ellas, 3 o 4 proteínas estructurales derivadas de la proteína precursora P1 constituyen el virus. la proteína de la cápside y las regiones P2 y P3 constituyen proteínas virales no estructurales. La UTR 3' del genoma tiene aproximadamente 50 nt a 100 nt y contiene una cola poli(a) 3' relacionada con la replicación y traducción del ARN viral [1]. Este artículo revisa el progreso de la investigación sobre la expresión genética del picornavirus.
1 Inicio de la traducción de los picornavirus
Después de que los picornavirus ingresan a la capa celular, pueden activar rápidamente las características estructurales de la traducción e iniciar el proceso de traducción. Todos estos virus tienen 5'UTR, que puede utilizar eficazmente el factor de iniciación de la traducción de la célula huésped para formar de forma independiente un elemento genético específico: IRES [2].
1.1 Entrada interna a los ribosomas
Los virus picorna no dependen del 7? El mecanismo de iniciación de la traducción de la estructura de la tapa de metilguanosina (estructura de la tapa m7) inicia el proceso de traducción. Durante la infección viral, la maquinaria de traducción de la célula huésped se apaga y los genes virales pueden seguir expresándose. Las características estructurales de los genomas de picornavirus pueden obstaculizar el mecanismo de iniciación de la traducción dependiente de la estructura del sombrero de la célula huésped. El ARN genómico viral del microARN no contiene la estructura de tapa m7, que es necesaria para la adición de complejos de unión de tapa de ARNm celular. El genoma viral tiene un codón de inicio falso en la 5'UTR para evitar el escaneo de ribosomas y formar un elemento IRES para mediar la entrada de ribosomas internos de modo que los ribosomas eucarióticos puedan unirse directamente al sitio de inicio de la traducción del ARN, en el codón de inicio verdadero inicia la traducción. . El factor de iniciación de la traducción eIF4G del huésped es una subunidad del complejo del factor de iniciación de la traducción eIF4F en las células y es responsable de la unión al ARNm en todo el complejo de iniciación de la traducción. Durante la infección por PV, la proteasa viral 3C escinde el factor de iniciación de la traducción del huésped eIF4G, lo que afecta su unión a la subunidad de la estructura del sombrero eIF4F, lo que provoca que la unión de eIF4E a otras subunidades del complejo inicial se vea afectada, inhibiendo la estructura del sombrero 5'-terminal. traducción del ARNm, cerrando así la traducción de la célula huésped.
Las proteasas PV 3C y coxsackievirus 2A pueden escindir PABP, inhibiendo así la traducción de la célula huésped [3]. La proteína líder (Lpro) del VFA puede escindir eIF4G e inhibir la traducción de las células huésped [4]. Sin embargo, en lugar de cortar el factor de inicio de la traducción para bloquear la traducción de la célula huésped, el EMCV altera 4E? ¿Actividad del inhibidor de la traducción EP1, 4E? EP1 puede unirse a la subunidad estructural hat eIF4E e inhibir la traducción de las células huésped. A excepción del VHA, la traducción del VHA requiere la participación completa de eIF4G y la infección viral no bloquea la traducción de las células huésped [5].
La secuencia y estructura secundaria del elemento IRES de los picornavirus se conserva entre virus de diferentes serotipos, lo cual es necesario para la supervivencia del virus. Según la similitud de secuencia y la homología estructural de los virus, el IRES de los picornavirus se puede dividir en tres tipos. El tipo I se encuentra en los enterovirus y los rinovirus humanos, y el tipo II se encuentra en los cardiovirus y los virus aftosos [6]. En los últimos años, se ha descubierto que la secuencia del elemento IRES y los motivos estructurales del Diejovirus son similares al IRES tipo II [7]. Se han encontrado elementos IRES de tipo III en el género del virus de la hepatitis. Las diferentes estructuras IRES representan características de diferentes virus, que determinan cómo y con qué rapidez se inicia la traducción en estos virus.
Elementos de ARN y factores celulares implicados en la traducción de 1.2 picornavirus
La secuencia y elementos estructurales de la 5’UTR de los picornavirus son necesarios para la traducción de los virus. La predicción de 5′UTR de enterovirus y rinovirus muestra que hay 6 bucles de tallo principales aguas arriba del sitio de inicio de la traducción, y el IRES está ubicado en la región entre los bucles de tallo II y V. El bucle de tallo IV juega un papel importante en la traducción viral. . La inserción de tres nucleótidos en el asa IV del tallo puede provocar la pérdida de infectividad del ARN viral. El bucle de tallo I (210 nt ~ 220 nt) es el bucle de tallo más grande. La estructura de cuatro anillos de GNRA juega un papel importante en la traducción viral y está altamente conservada entre los elementos IRES de tipo II. El virus de la fiebre aftosa pertenece al IRES de tipo II. Un solo cambio de nucleótido en la secuencia GNRA puede provocar una regulación negativa de 10 veces de la traducción del virus de la fiebre aftosa [8]. estructura.
Se han identificado varios factores celulares que interactúan con los elementos IRES de los picornavirus, y algunos de estos factores celulares están implicados en el inicio de la traducción viral. Dos factores proteicos, el autoantígeno del lupus (La) y la proteína de unión al fragmento de pirimidina (PTB), pueden activar la traducción de los picornavirus. La falta de citoquinas en el lisado de reticulocitos de conejo puede reflejar verdaderamente la traducción del virus. La adición de La recombinante al lisado de reticulocitos de conejo puede mejorar y corregir la traducción anormal de PV [9]. El virus de la fiebre aftosa también utiliza otra proteína celular, la ITAF 45. ¿Los experimentos muestran que PTB e ITAF? 45 puede tener un efecto sinérgico [10]. Los factores de iniciación de la traducción celular también se unen al IRES del ARN viral, como eIF4B, que se une a 48S y 80S en el complejo ribosomal y puede interactuar con el elemento IRES del virus de la fiebre aftosa [11].
En las células huésped, las proteínas de unión poli(C) y poli(A) (es decir, PCBP y PABP) participan en la formación de complejos que inician y ejecutan la función de traducción de genes virales. En experimentos in vitro, la eliminación de PCBP2 en el citoplasma de Hela puede reducir significativamente la eficiencia de traducción del ARN de PV, mientras que la adición de proteína PCBP2 recombinante puede restaurar la eficiencia de traducción del ARN al nivel anterior a la eliminación, lo que demuestra que PCBP2 está relacionado con la eficiencia de traducción de PV. [12]. Cuando PCBP2 interactúa con elementos IRES de tipo I y tipo II en la región 5 ′ UTR, solo se requiere traducción mediada por IRES de tipo I. Cuando el precursor de la polimerasa viral 3CD se acumula en las células, ¿puede 3CD pasar a través de la estructura de hoja de trébol (tallo-bucle I) y PCBP en el extremo 5' del ARN viral? ¿PABP? La unión del complejo de ARN desempeña un papel en la replicación del ARN viral [13].
Procesamiento de la poliproteína 2 viral
2.1 Escisión primaria: proteasa 2A y proteasa L.
La proteasa 2A es una proteína nucleófila de cisteína que es estructuralmente similar a la proteasa B de Streptomyces griseus similar a la quimotripsina [14]. Los virus picorna [1] tienen tres modos de escisión principales: el PV, el coxsackievirus y el rinovirus humano se escinden mediante la proteasa 2A en la unión de la proteína precursora P1-P2. La proteína 2A se pliega en una estructura funcional activa y la proteína viral se pliega. Se escinde de manera cis para producir la proteína precursora P2-P3 y la poliproteína de la región P1; el virus de la fiebre aftosa pertenece al género L-P1, y la proteína L se libera del extremo N de la poliproteína viral. Esta escisión primaria se realiza mediante proteasa L en su propio extremo C terminal de manera que actúa en cis. 2A en la poliproteína del FMDV solo tiene 16 residuos de aminoácidos. A través de la actividad proteasa del propio 2AB, se une a 2B y se escinde en el extremo C de 2A para formar P65436. Las secuencias de la proteína L de los cardiovirus y del virus aftoso tienen una baja homología de secuencia y no tienen actividad enzimática proteolítica. La escisión de su proteína L del precursor P1 está mediada por la proteasa 3C. La escisión primaria de cardiovirus es catalizada por el péptido NPGP en la región codificante 2A, que escinde la proteína 2A aguas abajo para producir L-P1-2A y P1-2A. La escisión del precursor de la poliproteína HAV se completa por completo con 3C. No existe una poliproteína viral de longitud completa en las células infectadas por picornavirus. El proceso de escisión inicial ocurre simultáneamente con el proceso de iniciación de la traducción, y el ARN viral y la poliproteína se combinan con los ribosomas. La proteasa 2A también escinde factores celulares implicados en la maquinaria de iniciación de la traducción dependiente de HAT [6]. Cuando se infectan enterovirus y rinovirus, la proteasa 2A escinde el componente eIF4G del complejo de unión al sombrero y detiene la traducción en la célula huésped. Durante las primeras etapas de la infección por el virus aftoso, la proteína L se escinde en el extremo N de la poliproteína, liberando la proteasa L, que escinde eIF4G e induce la interrupción de la síntesis de proteínas del huésped.
2.2 Escisión secundaria: proteína 3C
La proteína 3C es una proteína importante en el procesamiento de virus y la replicación del ARN. Tiene una cisteína como sitio activo para la interacción nucleófila y su estructura es similar a la triptófano proteasa similar a la quimotripsina [15]. Después de la escisión primaria, la proteína viral 3C (y la proteína precursora 3CD) realiza una escisión secundaria de la proteína precursora viral. 3C primero se escinde de la proteína precursora P3 y luego realiza un procesamiento importante entre las proteínas precursoras P2-P3 para producir proteínas de replicación viral. Después de la infección por PV, 3C o 3CD pueden escindir la PABP (la PABP puede ayudar al huésped a inhibir la traducción viral). Además, la proteína 3C también puede escindir proteínas de la célula huésped polⅰ, polⅱ y polⅲ relacionadas con el proceso de transcripción de las células eucariotas. Aunque los polipéptidos de la proteína 3C desempeñan un papel importante en el procesamiento de poliproteínas virales en múltiples etapas, la proteína precursora 3C-D de PV es más activa que la proteína 3C madura.
2.3 Proteínas virales implicadas en la replicación del ARN
En la región P2 de la poliproteína viral, la proteasa 2A no sólo juega un papel importante en el procesamiento inicial del virus, sino que también desempeña un papel importante en la replicación del ARN viral. La proteína 2B puede cambiar la membrana celular y aumentar la permeabilidad de la membrana celular, y puede desempeñar un papel importante en la liberación de partículas virales en las últimas etapas de la infección viral. Las mutaciones en el gen PV RNA 2B producen virus mutantes que forman placas defectuosas, lo que sugiere que se requiere 2B para la replicación del PV RNA. 2C y la proteína precursora 2BC son necesarios para los reordenamientos de la membrana interna inducidos por virus y la formación de vesículas citoplasmáticas. 2C puede unirse a la 3′UTR del ARN de cadena negativa de PV, lo que sugiere que desempeña un papel importante en la síntesis de ARN de cadena positiva. La proteína 2C tiene actividad ATPasa y contiene un motivo helicasa, pero no tiene actividad helicasa [16].
La proteína P3 juega un papel importante en la replicación del ARN viral y puede interferir con la respuesta inmune del huésped. La proteína 3A puede inhibir la expresión de histonas tipo I y el transporte de la membrana intracelular, y puede desempeñar un papel importante en la evasión del picornavirus de la respuesta inmune del huésped, lo que puede estar relacionado con la virulencia del virus y el alcance del huésped [17]. La proteína 3B (proteína VPg) es un cebador de proteína * * * valente que se une a los extremos 5' del ARN positivo y negativo. La región hidrofóbica de la proteína viral 3AB fue mutada y los resultados mostraron que 3AB está relacionado con la síntesis de ARN viral. Además, 3AB también puede promover la actividad de la ARN polimerasa viral 3D y promover la autoescisión de 3CD.
Las proteasas virales 3C y 3CD tienen múltiples funciones y están relacionadas con la unión del ARN viral, el procesamiento de proteínas y la replicación del ARN. La estructura de hoja de trébol (bucle de tallo I) en el extremo 5' del ARN de PV y coxsackievirus es el sitio de unión para el precursor de la proteasa viral 3CD. La interacción entre la proteína 3C en PV y la estructura de hoja de trébol del ARN juega un papel sinérgico con la célula huésped PCBP2 en la replicación del ARN. El sitio de unión 3CD en la estructura del trébol de ARN es necesario para la replicación del ARN PV, pero no para la traducción viral y la estabilización de la estructura del ARN. 3D es una ARN polimerasa viral dependiente de ARN que desempeña un papel en el VPg uracilo y el alargamiento de la cadena de ARN durante la síntesis de ARN viral. Cada vez que se replica cada plantilla de virus, habrá una falta de coincidencia de 1 a 2 nucleótidos en 3D, lo que provocará un aumento en el número de mutaciones y una evolución acelerada, lo que puede aumentar la adaptabilidad de la población de virus [6].
3 Mecanismo de replicación del ARN de los picornavirus
El primer paso en la replicación del ARN de los picornavirus es la síntesis de moléculas de ARN de cadena negativa. La traducción del ARN de cadena positiva debe terminar antes de que pueda comenzar la síntesis del ARN de cadena negativa. El mecanismo por el cual se interrumpe la traducción del ARN de cadena positiva aún no está claro. La replicación del ARN de cadena positiva y del ARN de cadena negativa requiere la replicasa 3D codificada por el propio virus, que cataliza la extensión de la cadena de ARN, participa en la combinación de las pequeñas proteínas virales VPg y Pupu e inicia el proceso de replicación. ¿VPg? Pupu sirve como cebador para la síntesis de ARN de cadena negativa, y la cola poli(A) en el extremo 3' del virus sirve como punto de partida para la síntesis de ARN de cadena negativa, iniciando la replicación del ARN de cadena negativa. El ARN de cadena negativa se utiliza como plantilla para sintetizar el genoma de ARN de cadena positiva, que está empaquetado en partículas virales, o se utiliza como plantilla para sintetizar proteínas virales, y el mecanismo de traducción independiente del sombrero se utiliza para guiar la síntesis de Proteínas virales. La síntesis de ARN de cadena negativa produce ARN de doble cadena (ARN replicante, RF) [1]. En las células infectadas con VP, la proporción entre ARN de cadena positiva y ARN de cadena negativa es aproximadamente 50:1, lo que indica que se puede utilizar un único ARN de cadena negativa como plantilla para sintetizar múltiples ARN de cadena positiva para formar parte del RF [6].
3.1 Elementos de ARN viral y proteínas celulares necesarios para la replicación del ARN
Algunas secuencias de ARN y estructuras secundarias de la 5′UTR de parvovirus son necesarias para la replicación del ARN viral [18]. La estructura de trébol terminal 5' de enterovirus y rinovirus es el sitio de unión para la proteína viral 3CD y la proteína del huésped PCBP 3CD se une al bucle D de la estructura del trébol y la proteína del huésped PCBP2 se une al bucle B. 3CD y PCBP2 se combinan con la estructura del trébol para formar un triplete con el ARN viral y desempeñan un papel en la replicación del ARN. La eliminación de la proteína PCBP2 de los extractos citoplasmáticos redujo la síntesis de ARN PV, lo que indica que se requiere PCBP2 para la replicación del ARN viral. La proteína celular PABP se une a la cola poli(A) terminal 3' del virus y luego interactúa con la proteína viral 3CD y la proteína celular PCBP2 unida a la estructura del trébol terminal 5'. Por lo tanto, a través de la interacción entre PABP y PCBP2, el ARN viral en los extremos 5' y 3' puede interactuar para promover el inicio de la replicación viral [19]. 3AB y 3CD de PV interactúan con la estructura de hoja de trébol del virus, afectando la replicación del ARN viral.
La región codificante del genoma del picornavirus contiene una estructura de horquilla de ARN conservada: un elemento de replicación que actúa en cis (cre). La estructura en horquilla consta de la secuencia AAACA, y los experimentos de mutación confirmaron que la secuencia cre es necesaria para la replicación del ARN viral. La sustitución de un único nucleótido en la secuencia AAACA bloquea la formación de un motivo circular que puede terminar la replicación del ARN viral y provocar la muerte del virus [20]. Se han identificado estructuras CRE en rinovirus, PV y cardiovirus humanos, y están ubicadas en diferentes posiciones del genoma ORF, mientras que la estructura CRE del FMDV está ubicada en la región 5'UTR del genoma [20]. Cre sirve como sitio de unión para las proteínas de replicación viral, que desempeñan un papel en la replicación del ARN viral, y como plantilla para la poliuria VPg.
El análisis de mutaciones muestra que la cre poliuria solo implica la síntesis de ARN de cadena positiva, y la síntesis de ARN de cadena negativa puede utilizar la cola poli(A) para la poliuria y la replicación inicial [21]. La interacción entre 3CD y cre, la estructura del trébol y el ARN conduce a la interacción entre el extremo 5' y el extremo 3' del ARN viral, lo que resulta en el reordenamiento estructural del ARN viral, que favorece la replicación eficiente del ARN.
3.2 Síntesis viral de ARN de cadena positiva y de cadena negativa
La replicación del ARN de cadena positiva comienza en el extremo 3' mediada por el ARN de cadena negativa, donde se unen las moléculas secundaria y terciaria. Las estructuras pueden desenredarse y las hebras de ARN se extienden. Aunque la proteína 2C del ARN PV no tiene actividad helicasa, la proteína 2C se une al extremo 3' del ARN de cadena negativa y ejerce actividad ATPasa. Además, la ARN polimerasa 3D es un ARN doble suelto que funciona como helicasa en la síntesis de ARN viral [22]. Las proteínas celulares también participan en la formación de complejos de iniciación del ARN viral y se han identificado varias proteínas celulares que interactúan con las estructuras del ARN viral. En células infectadas con PV se encontró una proteína celular, la proteína HNRNP C, que interactúa con la 3'UTR del ARN de cadena positiva. La eliminación o mutación del sitio de unión al ARN de esta proteína da como resultado una reducción de la síntesis de ARN y la supervivencia del virus [23].
La síntesis de ARN de cadena negativa es controvertida. Un modelo cree que el virus interactúa con la estructura del trébol al final de PABP, poli(A) y PCBP3CD 5', y el ARN viral forma una molécula ciclada y luego comienza la síntesis de ARN de cadena negativa [24]. Debido a que el ARN viral de cadena negativa se sintetiza en el citoplasma, hay tanto ARNm celular como colas poli(A) en el citoplasma. Los picornavirus deben desarrollar un mecanismo que asegure el reconocimiento de la polimerasa del ARN viral. Hay un motivo AAACA conservado en el bucle cre, y las dos primeras A de este motivo son plantillas para la síntesis de VPgpU y VPgpUpU, que inician la replicación viral [25]. Otro modelo sugiere que la síntesis de ARN de cadena negativa comienza en la cola poli(A) del genoma. En este modelo, las enzimas relacionadas con el huésped, como la transferasa terminal, añaden una poli(U) al extremo 3' del ARN del gen viral. Esta poli(U) es invertida y complementaria a la poli(A) del ARN viral. , formando una estructura en horquilla, que puede usarse como cebador de replicación para sintetizar ARN de cadena negativa [6].
4 Conclusión
En la actualidad, algunas cuestiones relacionadas con la expresión genética de los picornavirus aún no están claras. Los virus que pertenecen a la familia de los virus MicroRNA están altamente conservados en sus mecanismos genéticos. El estudio del mecanismo de expresión genética de los virus MicroRNA puede proporcionar una ayuda potencial en el tratamiento de enfermedades causadas por estos virus y reducir las pérdidas económicas, y también puede proporcionar materiales de referencia para estudiar la regulación de la expresión genética en eucariotas.