Contenido 1 Pinyin 2 Referencia en inglés 3 Descripción general 4 Examen médico de la actividad de la telomerasa 4.1 Nombre del examen 4.2 Clasificación 4.3 Principio de determinación de la actividad de la telomerasa 4.4 Reactivos 4.5 Método de operación 4.6 Valor normal 4.7 Importancia clínica de los resultados de la prueba 4.8 Nota 4.9 Enfermedades relacionadas 1 Pinyin
duān lì méi huó xìng 2 Referencia en inglés
Actividad de la telomerasa 3 Descripción general
Los telómeros son los extremos de los cromosomas eucariotas Una estructura especial que consta de una secuencia repetida de ADN rica en guanina y sus proteínas asociadas. Los telómeros son estructuras esenciales para proteger la estabilidad de los extremos de los cromosomas. El mantenimiento de la longitud de los telómeros requiere la presencia de actividad telomerasa. Las células inmortales y las células tumorales pueden sobrevivir durante mucho tiempo y la telomerasa juega un papel importante. La telomerasa es un complejo compuesto de ARN y proteína. Es una transcriptasa inversa dependiente de ARN específica que puede utilizar su propio ARN como plantilla para sintetizar ADN telomérico en el extremo de los cromosomas desde cero para compensar los telómeros durante la división celular. La pérdida de ADN mantiene la longitud de los telómeros, mantiene el equilibrio dinámico de los cromosomas y hace que las células sean inmortales. La telomerasa ha atraído una amplia atención desde que Kim estableció un método altamente sensible basado en PCR para detectar la telomerasa en 1994. Se ha descubierto que la telomerasa está estrechamente relacionada con la proliferación, diferenciación e inmortalidad celular, y se ha convertido en uno de los puntos calientes actuales en la investigación básica sobre tumores y envejecimiento. 4 Examen médico de la actividad de la telomerasa 4.1 Nombre de la prueba
Actividad de la telomerasa 4.2 Clasificación
Examen serológico gt; Detección inmune del tumor
4.3 Principio de medición de la actividad de la telomerasa
Tecnología de reacción en cadena de la polimerasa: La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción cíclica que consta de tres pasos básicos realizados in vitro. El primer paso de desnaturalización: calentar todos los fragmentos de genes amplificados para romper los enlaces de hidrógeno entre las dobles hebras y dividirlos en dos hebras de nucleótidos simples. El segundo paso de hibridación: cuando la temperatura baja, los núcleos oligoméricos sintetizados químicamente. Los cebadores de nucleótidos son compatibles; con el ADN en ambos lados del gen a amplificar; el tercer paso de extensión: en presencia de un tampón adecuado, es decir, iones de magnesio y cuatro tipos de desoxinucleótidos, la ADN polimerasa puede basarse fielmente en la base plantilla complementaria. La cadena se sintetiza a partir de la secuencia y se extiende desde el extremo 3' del cebador. La dirección de síntesis es 5'→3', sintetizando así dos moléculas de fragmentos de genes con la misma estructura que el original. Tres pasos constituyen un ciclo y el número de moléculas de ADN se duplica exponencialmente en cada ciclo. 4.4 Reactivos
Las condiciones básicas para la reacción en cadena de la polimerasa incluyen genoma de ADN o ARN purificado, nucleótidos individuales utilizados para sintetizar ADN, cebador oligonucleotídico de ADN polimerasa, varios tampones, capacidad rápida para cambiar la temperatura y un sistema de detección dedicado.
(2) Extracción y purificación de ADN/ARN: Igual que la extracción y purificación de ADN/ARN en tecnología de sondas de ácido nucleico en esta sección.
(2) Selección del cebador: primero, es necesario conocer las secuencias de ADN en ambos lados del fragmento del gen que se va a amplificar y luego utilizar la síntesis química para sintetizar un par de oligonucleótidos complementarios a las secuencias de ADN en ambos lados como cebadores, la longitud es generalmente de 20 a 30 nucleótidos. Se debe prestar atención a los siguientes puntos al seleccionar los cebadores: ① La secuencia es específica del gen que se va a amplificar; ② Las bases se distribuyen aleatoriamente para evitar montones de purinas o pirimidinas. ③ No formarán estructuras secundarias por sí mismas; El par de cebadores no deben ser complementarios.
(3) ADN polimerasa: use TaqDNA polimerasa, que puede soportar altas temperaturas, tiene un alto rendimiento y puede amplificar la longitud de más de 10 kb. Agregar la enzima una vez puede realizar un ciclo continuo.
4.5 Método de operación
El ADN genómico es de 0,1 μg; el tampón contiene 50 mmol/l de cloruro de potasio, 10 mmol/l de TrisHCl (pH 8,4), 1,5 mmol/l de cloruro de magnesio y 100 μg de gelatina; cada cebador es de 0,25 μmol/l; L; dATP, dCTP, dGTP y dTIP son cada uno de 200 μmol/L de ADN polimerasa, 2,5 U, y el volumen final es de 100 μl. Agrega unas gotas de parafina líquida para evitar la evaporación.
Ciclo de reacción: ① Desnaturalización: 90 ℃ 30 ~ 60 s; ② Temperatura de recocido del cebador y la plantilla: 40 ~ 60 ℃ 30 ~ 60 s; ③ Extensión: 72 ℃ 1 ~ 2 min. Después de ciclos repetidos de 30 a 40 veces, la última extensión del cebador a 72°C finalizó después de 7 minutos. Después de retirar la parafina líquida, el producto está listo para el análisis. Después de la electroforesis en gel de agarosa, la tinción con bromuro de etidio y la irradiación con luz ultravioleta, se pueden observar bandas fluorescentes de la longitud de amplificación esperada. Los productos también pueden someterse a hibridación Southern o de transferencia puntual con sondas de oligonucleótidos radiomarcadas o no radiomarcadas. Es más conveniente utilizar una máquina automática de PCR. Después de agregar los reactivos de reacción, la plantilla de ADN y la polimerasa TaqDNA al tubo de ensayo, colóquelo en la máquina automática con el programa ajustado, es decir, la temperatura de desnaturalización → recocido → extensión requerida. tiempo y número de ciclos. Si se lleva a cabo la reacción, se puede obtener un producto de amplificación satisfactorio. 4.6 Valor normal
Negativo. 4.7 Importancia clínica de los resultados de laboratorio
(1) Los pacientes con cáncer de hígado tienen una tasa de positividad de la telomerasa más alta (85) y los niveles de AFP de los pacientes con actividad de telomerasa positiva son significativamente más altos que aquellos con actividad de telomerasa negativa. La actividad de la telomerasa no se relacionó significativamente con el tamaño del tumor, el grado histológico y la metástasis del tumor. La telomerasa puede convertirse en un marcador tumoral para el diagnóstico de cáncer de hígado.
(2) La telomerasa se expresa en niveles elevados en la mayoría de los tejidos tumorales malignos, como el neuroblastoma (94), el cáncer de mama (93), el cáncer colorrectal (93), el cáncer gástrico (85) y el cáncer de próstata. (84), cáncer de pulmón (80), etc. La actividad de la telomerasa está estrechamente relacionada con el estadio clínico y el pronóstico de los tumores. Por tanto, la telomerasa es actualmente el marcador tumoral más específico y universal.
(3) Puede haber una actividad de telomerasa muy débil en tejidos con algunas lesiones benignas (como hepatitis, cirrosis, meningiomas benignos, etc.). 4.8 Notas
En los últimos años, la "hipótesis de los telómeros y la telomerasa" ha sido confirmada por cada vez más estudios, utilizando el nivel de actividad de la telomerasa como biomarcador e indicador pronóstico para el diagnóstico de tumores. 4.9 Enfermedades relacionadas