El DS se puede extraer mediante el método de sal neutra, método ácido, método alcalino, método de hidrólisis enzimática, etc. En la actualidad, se utiliza principalmente el método de combinación de extracción alcalina y extracción enzimática.
Gao Hua et al. aumentaron la concentración de álcali en el método de extracción por hidrólisis álcali-enzimática y utilizaron una solución de hidróxido de sodio de 1 mol/L para extraer durante 2 horas. Esto acortó el tiempo y evitó la precipitación de impurezas. El rendimiento de DS fue el mismo. La pureza alcanzó el 32,6% y el 95,2% respectivamente.
Xu Chuan et al. utilizaron acetato de sodio al 2% para hidrolizar el cartílago de tortuga de caparazón blando antes de extraer DS. El contenido de nitrógeno del producto se pudo reducir en un 0,67%, mientras que la fracción de masa de hexosamina aumentó en un 1,87. %. Cierto valor de la producción industrial.
Li Ruiguo llevó a cabo cuatro procesos de extracción: hidrólisis álcali-enzimática concentrada (I), hidrólisis álcali-enzimática diluida (II), hidrólisis enzimática álcali diluida y sal diluida (III), y álcali diluido y sal concentrada. (IV) Después de la comparación, se encontró que el tiempo de extracción del proceso I es corto, el producto es de color oscuro y el peso molecular es pequeño. Los procesos II, III y IV son más fáciles de operar, el color del producto es bueno y; el peso molecular es mayor, especialmente el producto elaborado mediante el proceso IV es de mejor calidad.
Hua Ziyi utiliza un método de hidrólisis enzimática doble de enzima compleja alcalina y tripsina para extraer CS. El rendimiento es 1% -2% mayor que el método tradicional, el ciclo de producción se acorta en 1/3 y. El coste de producción se reduce en un 5%.
Nakano et al. primero trataron previamente el cartílago nasal bovino con 0,1 mol/l de acetato de sodio a pH 4,5 y 37 °C, de modo que el tejido del cartílago pudiera descomponerse automáticamente bajo la acción de enzimas endógenas, eliminando la necesidad de utilice enzimas exógenas. El costo de producción se reduce y se puede obtener una mezcla de GAG que contiene 89% de DS mediante purificación por cromatografía de intercambio iónico DEAE. Las diferentes solubilidades y densidades de carga de varios GAG se pueden utilizar para fraccionar y purificar CS. Los métodos de separación comúnmente utilizados incluyen precipitación con etanol, precipitación con solución salina, complejación con sales cuaternarias y cromatografía de intercambio iónico, entre los cuales la precipitación con etanol es el más utilizado.
Gao Hua et al. utilizaron un proceso para concentrar primero el hidrolizado enzimático a baja temperatura y presión reducida, y luego precipitarlo con etanol, lo que puede reducir la cantidad de etanol y aumentar el rendimiento del producto.
Cuando Zhang Zheng et al. separaron y purificaron DS, primero usaron filtración en gel Sephadex G-10 y luego usaron resina de intercambio iónico macroporosa D061 para la cromatografía de intercambio iónico. La pureza se pudo aumentar al 99,7%. En los últimos años, la tecnología de membranas también se ha utilizado para la separación y purificación de CS.
Lignot et al. han confirmado la viabilidad de la tecnología de ultrafiltración para concentrar y purificar DS a través de estudios comparativos, y han demostrado que una membrana de ultrafiltración con un tamaño de poro de 0,1 µm tiene el mejor efecto de separación. Existen muchos métodos para analizar DS. En general, existen métodos de cromatografía líquida de alta resolución, espectrofotometría, electroforesis y análisis estructural.
1. Cromatografía líquida de alta resolución
Algunos de los compuestos de glucosaminoglucanos contienen grupos éster de sulfato, otros no contienen grupos éster de sulfato y los que contienen grupos éster de sulfato contienen muchos grupos éster de sulfato. Cada isómero contiene una gran cantidad de otros componentes en la base lipídica DS, por lo que a menudo es necesario separarlos antes de la medición.
La estructura de la unidad de disacárido DS contiene grupos éster de sulfonato y grupos de ácido carboxílico extremadamente fuertes. Es soluble en agua y tiene un gran peso molecular. La cromatografía líquida de alto rendimiento se utiliza principalmente para separar y detectar diferentes componentes.
La detección ultravioleta de glucosaminoglicanos tras hidrólisis y separación mediante cromatografía líquida de alta resolución tiene una trayectoria de más de 20 años, y la investigación en este campo también ha avanzado mucho en los últimos años. Los métodos de análisis específicos son:
(1) Método de identificación por fluorescencia de hidrólisis de proteasa-endo-β-xilosidasa;
(2) Método de quimioluminiscencia;
(3 ) Método de determinación de separación directa;
(4) Cromatografía de iones de nitrificación, etc.
2. Espectrofotometría
El DS se disuelve en agua y se convierte en un líquido viscoso, incoloro y transparente con un pico de absorción en la región ultravioleta de 180-200 nm. En este rango de longitud de onda hay demasiadas sustancias perturbadoras con absorción. Si las sustancias existentes no se separan, la medición no tiene importancia real.
El contenido de CS se puede medir en la región de luz visible utilizando la reacción de color entre el grupo éster de sulfato reactivo y el grupo acetilamino en la unidad estructural del disacárido y varios reactivos cromogénicos. Se puede dividir en dos situaciones:
(1) el DS reacciona con el agente cromogénico para desarrollar color sin hidrólisis. Los métodos incluyen el método del derivado de tiazol, el método Bidukeng, etc.;
(2) Después de la hidrólisis, reacciona con un agente cromogénico para desarrollar color. Los métodos incluyen el método de acetilacetona-p-dimetilaminobenzaldehído, el método de floroglucinol, el método de azul de metileno, etc.
3. Método de electroforesis
El método de electroforesis tiene una preparación de muestra simple, una dosis pequeña y un tiempo de análisis corto, y se puede aplicar al análisis cuantitativo de DS.
En comparación con los métodos tradicionales, este método no requiere un proceso de pretratamiento de muestras complicado y el tiempo de análisis se reduce considerablemente.
4. Métodos de análisis estructural
Los métodos utilizados actualmente para el análisis de estructura DS incluyen principalmente IR, UV, HPLC, CE, MS, NMR, etc.