La extracción de plásmidos se puede dividir en tres partes
1. Lisis celular
Separación del ADN plasmídico y del ADN cromosómico
3.
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Construcción e identificación del plásmido de expresión eucariota del gen CD40Ig de ratón
1 Materiales y métodos
1.1 Animales experimentales Se adquirieron ratones Balb-c, hembras, de 6 semanas de edad, en el Departamento de Animales Experimentales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Pekín.
1.2 Plásmidos, cepas, líneas celulares y reactivos principales plásmido pEGFP-N1, plásmido vector pGEM-T, Escherichia coli. DH5A (Compañía Tiangen). Línea celular HEK293 de bajo paso (Original Zhengyang). Kit AdMaxTM Kit E (Microbix Biosystems, Inc.). Enzima Taq, ADN ligasa T4 (Takara Corporation). Las endonucleasas de restricción incluyen xmaⅰI, Bgl y Hindⅲ (Biolabs). Reactivo Trizol, Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kit de transcripción inversa, PCR Master Mix (MBI). Kit de extracción de plásmidos y purificación de geles (QIAGEN). Medio DMEM alto en glucosa, suero fetal de ternera, tripsina (Gibco). La síntesis de cebadores fue completada por Shanghai Gongsheng Company y la secuenciación de genes fue completada por Beijing Nosay Gene Research Center Co., Ltd..
1.3 Construcción del plásmido de expresión eucariota del gen CD40Ig de ratón
1.3 1. Extracción de ARN total del bazo de ratón: los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical y se extirparon los bazos. Después de la trituración con nitrógeno líquido, se extrajo el ARN total utilizando el reactivo Trizol. El método se realiza según las instrucciones del producto.
Preparación de genes CD40, IgG2a Fc y GFP en 1.3.2: Utilice ARN total de bazo de ratón como plantilla, oligo-dT como cebador, RT-PCR para sintetizar ADNc y luego utilice CD40 y mIgG Fc específicos Se usaron cebadores como moldes para la amplificación por PCR y el plásmido pEGFP-N1 se usó como molde para la amplificación por PCR. Los cebadores y las condiciones de reacción de PCR se muestran en la Tabla 650.
1.3.3 Construcción del plásmido pGEM-IgG: realizar la reacción de ligación TA en los productos de PCR de IgG Fc y el plásmido pGEM-T, es decir, agregar 10 µl de producto de PCR a 2 µl de vector pGEM-T y 10 U de ligasa T4. La temperatura es de 16ºC durante la noche. Utilice el método del cloruro de calcio para transformar 2 l del producto de ligadura en E. coli DH5α y utilice el método de la mancha azul-blanca para detectar clones de manchas blancas que contengan resistencia a la ampicilina. El plásmido pGEM-IgG se extrajo y se secuenció en 3 ml de medio LB (que contenía 100 µg/ml de ampicilina) a 37°C y 80 r/min durante la noche.
1.3.4 Construcción del plásmido p516-IgG: pGEM-IgG y pDC516 se digirieron con Bgl II respectivamente y los productos se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa 1,0. El fragmento de IgG y el vector lineal pDC516 se ligaron durante la noche usando ligasa T4 16 a una relación de concentración molar de 7:1. Tome 5 l del producto de ligación y transfórmelo en E. coli DH5α competente. Utilice la combinación de cebador pDC516-f y mIgG-r para detectar el recombinante insertado hacia adelante (consulte la Tabla 2). extraer el plásmido y secuenciarlo.
1.3.5 Construcción del gen de fusión del plásmido p516-CD40-IgG: Los productos de PCR de CD40 y p516-IgG se digirieron con Xma I respectivamente y el fragmento de CD40 se conectó al vector lineal pDC516-IgG. (el método es el mismo que el anterior). Después de transformar E. coli DH5α, utilice la combinación de cebadores pDC516-f y CD40-r (consulte la Tabla 2) para la detección por PCR de colonias, cultive el recombinante con resultados positivos, extraiga el plásmido y secuencie.
1 . 3 . 6 Construcción del plásmido pDC516-CD40-IgG-GFP: Los productos de PCR de GFP y PDC 516-CD40-IgG se digirieron con Hind respectivamente y el fragmento de GFP se combinó con pDC516-. Ligadura de vector lineal CD-IgG (igual que arriba), usando GFP-IgG.
1 . 3 . 7 Preparación por lotes del plásmido PDC 516-CD40-IgG-GFP: Prepárelo según las instrucciones del kit de purificación de plásmido libre de endo de Qiagen y el producto se confirma mediante 1 electroforesis en gel de agarosa (consulte). Figura 2), mida el valor de DO con un espectrofotómetro UV, filtre, esterilice y almacene a -20 °C para su uso posterior.
1.3.8 Transfección de 293 células con plásmido recombinante: Inocular 2,0×105 células en 2 ml de DMEM que contenga suero libre de antibióticos en una placa de 6 pocillos y cultivarlas en una incubadora que contenga 5 CO2 y 37°C durante 24 h, de modo que las células cubran del 60 al 70% de la placa durante la transfección. Utilice el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 para transfectar el plásmido recombinante y preparar dos soluciones A y B en tubos EP estériles. Solución A: disolver 4,0 µg de ADN en 250 µl de DMEM sin suero, mezclar suavemente Solución B: disolver 10 µl de Lipofectamine 2000 en 250 µl de medio sin suero, mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Mezcle la solución A y la solución B e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar complejos liposoma/ADN. Reemplace el medio de cultivo antiguo en la placa de 6 pocillos, agregue nuevamente 2 ml de DMEM que contenga suero y sin antibióticos y agregue gota a gota 500 l de complejo liposoma/ADN. Incubar en una incubadora que contenga 5 CO2 y 37 °C durante 24 h y luego reemplazar el líquido.
2 resultados
2.1 Obtener la región extracelular CD40 de ratón, el fragmento Fc de IgG2a y los cebadores del gen GFP CD40-f y CD40-r. El fragmento del gen de la región extracelular CD40 de ratón tiene 572 pb. El fragmento fc de IgG2a de ratón amplificado por los cebadores mIgG-f y mIgG-r tiene 700 pb. El fragmento del gen GFP amplificado por los cebadores GFP-f y GFP-r tiene 765 pb. Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa se muestran en la Figura 1.
2.2 Construcción exitosa del plásmido de expresión eucariota PDC 516-CD40-IgG-GFP
2. 1 Construcción del plásmido de expresión PDC 516-IgG: el vector pGEM-T tiene 3 000 pb. el plásmido pGEM-IgG construido tiene 3700 pb. El plásmido PGEM-T contiene la secuencia del cebador T7 110 pb aguas arriba del sitio de clonación múltiple. La combinación de cebadores T7 mIgG-r puede amplificar un fragmento de aproximadamente 810 pb, y la secuenciación del cebador T7 confirmó la corrección de la secuencia de IgG. El fragmento de IgG se conectó al vector lineal pDC516 y la corrección de la secuencia de inserción de IgG se confirmó mediante secuenciación de pDC516-f (ver Figura 3).
2. 2. 2 Construcción de PDC 516-CD40-IgG: Conecte el fragmento CD40 al vector lineal pDC516-IgG y confirme la corrección de la secuencia de inserción de CD40 mediante la secuenciación con el cebador PDC 516-F.
2 2 . 3 Construcción del plásmido pDC516-CD40-IgG-GFP: conecte el fragmento de GFP al vector lineal PDC 516-CD40-IgG y confirme la exactitud de la secuencia de inserción de GFP a través de pDC516-. secuenciación. El producto de fusión CD40-IgG-GFP que contiene sitios de restricción tiene 2001 pb y codifica 667aa (consulte la Figura 4).
2.3 Después de extraer el plásmido de expresión del plásmido recombinante pDC516-CD40-IgG-GFP en células eucariotas, el valor de DO detectado por un espectrofotómetro UV fue de 0,1257. El día 4 después de la transfección de 293 células con Lipofectamine 2000, se observó expresión de GFP en células esporádicas.
A medida que pasó el tiempo, la cantidad de células que expresaban GFP aumentó gradualmente y alrededor del día 7, una gran cantidad de células mostraron fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia (ver Figura 5).
Materiales de referencia:
/yixue/081031/16370955-2 html
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