Existen cinco métodos principales para determinar el contenido de proteínas: el método Kjeldahl, el método biuret, el método de absorción ultravioleta, el método del reactivo de fenol y el método del azul brillante de Coomassie.
1. Método de determinación de nitrógeno de Kjeldahl:
Las proteínas son compuestos que contienen nitrógeno. La comida se calienta y se digiere con ácido sulfúrico concentrado y catalizador para descomponer la proteína. El amoníaco producido se combina con el ácido sulfúrico para formar sulfato de amonio, que permanece en el jugo digestivo. Luego se agrega álcali para destilar el amoníaco y liberarlo. absorbiéndolo con ácido bórico, luego se usa como estándar con ácido clorhídrico. Para la titulación de la solución, multiplique el factor de conversión de proteínas por el consumo de ácido para obtener el contenido de proteína. Porque además de proteínas, los alimentos también contienen otras sustancias nitrogenadas, por eso esta proteína se llama proteína cruda.
2. Método de determinación del nitrógeno del biuret:
En una solución alcalina fuerte, el biuret y el CuSO4 forman un complejo púrpura, que se denomina reacción del biuret. Cualquier compuesto con dos grupos amida o dos enlaces peptídicos conectados directamente, o un enlace peptídico que pueda conectarse a través de un átomo de carbono intermedio, tiene una reacción de biuret. El color del complejo violeta es directamente proporcional a la concentración de proteínas y no tiene nada que ver con el peso molecular de las proteínas ni con la composición de aminoácidos, por lo que puede usarse para determinar el contenido de proteínas. El rango de medición es de 1 a 10 mg de proteína. Las principales sustancias que interfieren con esta determinación incluyen: sulfato de amonio, tampón Tris y ciertos aminoácidos.
3. Método de determinación del nitrógeno por absorción ultravioleta:
En las moléculas de proteínas, los anillos de benceno de los residuos de tirosina, fenilalanina y triptófano contienen dobles enlaces conjugados con ***, de modo que la proteína tiene la propiedad de absorber la luz ultravioleta. La cantidad de producto colorante formado depende de la concentración de proteína. Durante la medición real, se debe preparar previamente una curva de calibración estándar con una solución de proteína estándar; generalmente se utiliza una solución acuosa de albúmina sérica bovina como solución estándar de proteína.
Después de añadir reactivo de biuret a soluciones estándar de proteínas de diferentes concentraciones, se mide la absorbancia del producto de color generado por la reacción a una longitud de onda de 540 nm con un espectrofotómetro UV-visible, utilizando reactivo de biuret más tampón o agua. como un Contraste en blanco. Luego, los valores medidos se representaron frente a la concentración de proteína (mg/ml) para obtener una curva estándar.
Utilice el reactivo de biuret para tratar la muestra de proteína desconocida de la misma manera y verifique directamente la concentración de proteína en la muestra de proteína desconocida según el valor de absorbancia medido en la curva estándar. Al medir mediante el método de absorción UV, dado que el pico de absorción de proteínas a menudo cambia debido a cambios en el pH, se debe prestar atención al valor de pH de la solución. El pH al medir la muestra debe ser consistente con el pH de la curva estándar.
4. Método del reactivo de fenol:
El principio de desarrollo del color de este método es el mismo que el del método biuret, excepto que se añade un segundo reactivo, el reactivo de folin-fenol. la cantidad de desarrollo de color, mejorando así la sensibilidad de detección de proteínas. Las razones por las que estas dos reacciones de color producen azul oscuro son:
① En condiciones alcalinas, los enlaces peptídicos de la proteína se combinan con el cobre para formar un complejo.
②El folin-fosfomolibdato en el reactivo de fenol-fosfotungstato se reduce por los residuos de tirosina y fenilalanina en las proteínas para producir un color azul intenso (una mezcla de azul de molibdeno y azul de tungsteno). En determinadas condiciones, la profundidad del azul es proporcional a la cantidad de proteína.
5. Método Coomassie Brilliant Blue:
El tinte Coomassie Brilliant Blue G-250 se combina con proteínas en una solución ácida, de modo que la posición del pico de máxima absorción del tinte (λmax) es determinado por 465 nm cambió a 595 nm, y el color de la solución también cambió de marrón-negro a azul. Según las investigaciones, los colorantes se combinan principalmente con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y residuos de aminoácidos aromáticos en las proteínas. El valor de absorbancia A595 medido a 595 nm es directamente proporcional a la concentración de proteína.
Información ampliada
Proceso de inspección
(1) Método estándar para desarrollar la curva estándar: Tome 14 tubos de ensayo, divídalos en dos grupos y opere en paralelo según a la mesa a. Dibuje una curva estándar: con A595nm como ordenada y el contenido de proteína estándar como abscisa, dibuje una curva estándar en papel cuadriculado.
(2) Desarrollar la curva estándar mediante micrométodo. Tome 12 tubos de ensayo, divídalos en dos grupos y opere en paralelo de acuerdo con la Tabla b. Dibuje una curva estándar: con A595nm como ordenada y el contenido de proteína estándar como abscisa, dibuje una curva estándar en papel cuadriculado.
(3) Determinación de la concentración de proteína de la muestra desconocida: el método de determinación es el mismo que el anterior; tome un volumen de muestra desconocido apropiado para que el valor medido esté dentro del rango de la línea recta de la curva estándar. Según el valor medido de A595nm, encuentre la cantidad equivalente a la proteína estándar en la curva estándar para calcular la concentración de proteína (mg/ml) de la muestra desconocida.
Material de referencia Enciclopedia Baidu - Determinación del contenido de proteínas