2 Referencia en inglés Tecnología de anticuerpos fluorescentes
3 Descripción general En 1941, Coons et al. etiquetado con éxito con fluoresceína por primera vez. Esta técnica de localizar antígenos marcando anticuerpos con sustancias fluorescentes se denomina tecnología de anticuerpos fluorescentes. El inmunoensayo de fluorescencia es uno de los primeros inmunoensayos marcados. Durante mucho tiempo, algunos estudiosos han intentado combinar moléculas de anticuerpos con algunas sustancias trazadoras y utilizar reacciones antígeno-anticuerpo para localizar sustancias antigénicas en tejidos o células.
La determinación cuantitativa mediante inmunoensayos fluorescentes es difícil debido al alto nivel de fondo en los ensayos de fluorescencia convencionales. En los últimos años, se han desarrollado varios inmunoensayos fluorescentes especiales, como el inmunoensayo enzimático y el radioinmunoensayo, para pruebas clínicas.
4 Fenómeno de fluorescencia 4.1 Generación de fluorescencia: esta sustancia química puede absorber y almacenar energía (como energía luminosa, energía química, etc.) desde el exterior al estado excitado. Cuando regresa del estado excitado al estado fundamental, el exceso de energía puede irradiarse en forma de radiación electromagnética (es decir, emitir luz).
La característica de la emisión de fluorescencia es que las moléculas o átomos que pueden producir fluorescencia emiten luz inmediatamente después de recibir energía; una vez que se detiene el suministro de energía, el fenómeno de luminiscencia (fluorescencia) desaparece instantáneamente.
Hay muchos tipos de energía que pueden causar fluorescencia. La fluorescencia producida por la excitación de la luz se llama fluorescencia. Lo causado por reacciones químicas se llama fluorescencia química, y lo causado por rayos X o rayos catódicos se llama fluorescencia de rayos X o fluorescencia de rayos catódicos respectivamente. Los inmunoensayos de fluorescencia generalmente utilizan sustancias fluorescentes para el etiquetado.
4.2 Eficiencia de la fluorescencia Las moléculas fluorescentes no convertirán toda la energía luminosa absorbida en fluorescencia, sino que siempre la liberarán más o menos en otras formas. La eficiencia de la fluorescencia se refiere al porcentaje de moléculas fluorescentes que convierten la energía luminosa absorbida en fluorescencia, que es proporcional al valor cuántico de la fluorescencia emitida.
Eficiencia de fluorescencia = la cantidad de luz emitida (intensidad de fluorescencia)/la cantidad de luz absorbida (intensidad de excitación)
El número cuántico de luz fluorescente, es decir, la intensidad de fluorescencia, No solo se ve afectado por la intensidad de la luz de excitación. La influencia también está relacionada con la longitud de onda de la luz de excitación. Cada molécula fluorescente tiene su espectro de absorción y espectro de emisión (espectro de fluorescencia) específicos, es decir, hay un pico máximo de absorción y un pico máximo de emisión a una determinada longitud de onda. Cuando la longitud de onda de la luz de excitación se selecciona cerca de la longitud de onda del pico de absorción máxima de la molécula fluorescente, y la onda de luz de medición está cerca del pico de emisión máximo, la intensidad de la fluorescencia también es la mayor.
4.3 Extinción de la fluorescencia Después de ser irradiadas por luz de excitación durante un largo tiempo, la capacidad de radiación de las moléculas fluorescentes se debilitará o incluso se extinguirá. Esto se debe a que los electrones de las moléculas excitadas no pueden regresar al estado fundamental. , y la energía absorbida no puede devolverse al estado fundamental. Se emite en forma de fluorescencia. Algunos compuestos tienen un efecto de extinción de la fluorescencia natural y se utilizan como inhibidores para eliminar la fluorescencia innecesaria. Por lo tanto, al almacenar sustancias fluorescentes, se debe tener cuidado de evitar la exposición directa a la luz (especialmente la luz ultravioleta) y el contacto con otros compuestos. Algunos tintes no fluorescentes, como el azul de metileno y la fucsina básica, se utilizan habitualmente en técnicas de anticuerpos fluorescentes. Tiñe la muestra adecuadamente con azul de Evans o una solución de baja concentración de permanganato de potasio y yodo para debilitar la esencia de la fluorescencia no específica y hacer que la fluorescencia específica sea más prominente.
5 Sustancias Fluorescentes 5.1 Pigmentos Fluorescentes Muchas sustancias pueden producir fluorescencia, pero no todas las sustancias pueden usarse como pigmentos fluorescentes. Sólo aquellos compuestos orgánicos que pueden producir una fluorescencia obvia y pueden usarse como tintes pueden denominarse pigmentos inmunofluorescentes o tintes fluorescentes. Los pigmentos fluorescentes comúnmente utilizados son:
1. El tiocianato de fluoresceína (FITC) es un polvo cristalino de color amarillo o naranja que es fácilmente soluble en disolventes como agua o alcohol. El peso molecular es 389,4, la longitud de onda de absorción máxima es 490495 nm y la longitud de onda de emisión máxima es 520530 nm, lo que muestra una fluorescencia de color amarillo verdoso brillante. La fórmula estructural es la siguiente:
Hay dos estructuras isomorfas, entre las cuales. El isómero ⅰ es la luciferina más utilizada porque tiene mejor eficiencia, estabilidad y capacidad de unión a proteínas y puede almacenarse en lugares fríos, oscuros y secos durante muchos años. Sus principales ventajas son: ① El ojo humano es sensible al color amarillo verdoso. ② La fluorescencia verde en las muestras cortadas suele ser menor que la roja.
2. La tetraetil rodamina (RIB200) es un polvo de color naranja, insoluble en agua, soluble en etanol y acetona.
De naturaleza estable y puede almacenarse durante mucho tiempo. La fórmula estructural es la siguiente:
La longitud de onda de absorción máxima es de 570 nm, la longitud de onda de emisión máxima es de 595 ~ 600 nm y muestra fluorescencia naranja.
3. El isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) tiene la siguiente fórmula estructural:
La longitud de onda de absorción máxima es de 550 nm, la longitud de onda de emisión máxima es de 620 nm y muestra una fluorescencia de color rojo anaranjado. En comparación con la fluorescencia verde esmeralda de FITC, se puede utilizar para etiquetado doble o tinción de contraste. Su grupo isotiocianato puede unirse a proteínas, pero su eficiencia de fluorescencia es baja.
5.2 Otras sustancias fluorescentes 1. Sustancias que producen fluorescencia después de la acción de las enzimas. Algunos compuestos en sí mismos no tienen efecto fluorescente una vez que las enzimas actúan sobre ellos, formarán sustancias altamente fluorescentes. Por ejemplo, la β-galactosidasa descompone el βD galactopiranósido de la 4-metilumbeliferona en 4-metilumbeliferona, que puede emitir fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 450 nm. Otros como el 4-metilumbeliferado como sustrato de la enzima del ácido alcalino, el ácido p-hidroxifenilacético como sustrato de la peroxidasa de rábano picante, etc.
2. Quelatos de lantánidos. Ciertos quelatos de lantánidos trivalentes de tierras raras, como el europio (Eu3+), el terbio (Tb3+) y el cerio (Ce3+), también pueden emitir luz después de la excitación, entre los que se encuentra el Eu3+. es el más utilizado. Los quelatos Eu3+ tienen un amplio rango de longitudes de onda de excitación, un rango estrecho de longitudes de onda de emisión y un largo tiempo de caída de la fluorescencia, por lo que son los más adecuados para inmunoensayos de fluorescencia.
6 Preparación de anticuerpos fluorescentes 6.1 El marcaje con fluoresceína de los anticuerpos utilizados para marcar anticuerpos requiere una alta especificidad y afinidad. El antisuero utilizado no debe contener anticuerpos dirigidos contra el tejido normal de la muestra. En términos generales, la IgG debe purificarse y extraerse antes del etiquetado. Como marcador, la fluoresceína debe cumplir los siguientes requisitos: ① Debe tener un grupo químico que pueda formar un enlace de valencia con una molécula de proteína. No debe disociarse fácilmente después de combinarse con la proteína, y los pigmentos no unidos y sus productos de degradación deben cumplir. ser fácil de quitar. ② Alta eficiencia de fluorescencia, aún puede mantener una alta eficiencia de fluorescencia después de unirse a proteínas. ③El color de la fluorescencia contrasta fuertemente con el color del tejido de fondo. ④ La unión a proteínas no afecta las propiedades bioquímicas e inmunes originales de la proteína. ⑤El método de marcado es simple, seguro y no tóxico. ⑥La combinación con proteínas es estable y fácil de almacenar.
Existen dos métodos comúnmente utilizados para el etiquetado de proteínas: agitación y diálisis. Tomando el etiquetado FITC como ejemplo, el método de etiquetado por agitación es: primero equilibrar la solución de proteína que se va a marcar con 0,5 ml/l de tampón de carbonato pH 9,0, luego agregar la solución FITC gota a gota con agitación magnética y agitar continuamente durante 4 a 6 horas. a temperatura ambiente. Tomar el sobrenadante como marcador. Este método es adecuado para marcar grandes volúmenes de soluciones de anticuerpos con alto contenido de proteínas. La ventaja es que el tiempo de etiquetado es corto y la cantidad de fluoresceína es pequeña. Sin embargo, este método tiene muchos factores que influyen si no se realiza correctamente, provocará una fuerte tinción fluorescente no específica.
El método de diálisis es adecuado para soluciones de anticuerpos con pocas muestras marcadas y bajo contenido en proteínas. Este método marca de manera relativamente uniforme y tiene una tinción no específica baja. El método es el siguiente: primero coloque la solución de proteína que se va a etiquetar en una bolsa de diálisis, colóquela en un tampón de carbonato de pH 9,4 de 0,01 mol/L que contenga FITC para que reaccione durante la noche y luego dialice con PBS para eliminar el pigmento libre. Centrifugar a baja velocidad y recoger el sobrenadante.
Después del etiquetado, los anticuerpos marcados deben purificarse aún más para eliminar la fluoresceína libre no unida y el exceso de anticuerpos unidos a fluoresceína. Los métodos de purificación pueden ser diálisis o separación cromatográfica.
6.2 Identificación de anticuerpos fluorescentes Los anticuerpos fluorescentes deben identificarse antes de su uso. Los indicadores de identificación incluyen el título y la tasa de unión de la fluoresceína a la proteína. El título de anticuerpos se puede titular mediante el método de doble difusión en agar. El título ideal es superior a 1:16. El método básico para calcular la relación de unión de fluoresceína a proteína (F/P) es: diluir el anticuerpo fluorescente preparado a A2801≈1.0 y medir A280 (pico de absorción específico de proteína) y el pico de absorción específico de fluoresceína marcada respectivamente. según la fórmula.
Cuanto mayor sea el valor F/P, más fluoresceína se unirá a la molécula de anticuerpo, y viceversa. Generalmente, F/P = 1,5 es un anticuerpo fluorescente adecuado para muestras fijadas y F/P = 2,4 es un anticuerpo fluorescente adecuado para la tinción de células vivas.
El método para determinar la concentración de trabajo del anticuerpo es similar a la titulación del anticuerpo marcado con enzima en el método indirecto ELISA. El anticuerpo fluorescente se diluyó de 1:4 a 1:256 veces y las muestras seccionadas se tiñeron con anticuerpos fluorescentes. La concentración de trabajo de anticuerpos fluorescentes es la dilución más alta que muestra claramente una fluorescencia específica y una tinción débil e inespecífica.
Al almacenar anticuerpos fluorescentes, se debe tener cuidado para evitar la inactivación de los anticuerpos y la extinción de la fluorescencia. Lo mejor es envasar en lotes pequeños y congelar a -20°C, para que pueda conservarse durante 3 a 4 años. Generalmente, se puede almacenar a 4 ℃ durante 1 a 2 años.
7 Microscopía de inmunofluorescencia El principio básico de la microscopía de inmunofluorescencia es: hacer reaccionar anticuerpos fluorescentes con antígenos en la superficie de tejidos o células en secciones de muestras, eliminar los anticuerpos fluorescentes libres y observar bajo un microscopio de fluorescencia la fluorescencia específica brillante. es visible sobre un fondo más oscuro.
7.1 Preparación de muestras La tecnología de microscopía de fluorescencia se basa principalmente en la observación de los resultados de la tinción de anticuerpos fluorescentes en muestras seccionadas como identificación y posicionamiento de antígenos. Por lo tanto, la calidad de la preparación de la muestra afecta directamente los resultados de la prueba. Durante el proceso de preparación de la muestra, se deben hacer esfuerzos para mantener la integridad del antígeno, de modo que no se disuelva ni se desnaturalice durante la tinción, el lavado y el sellado, y que no se propague a las células adyacentes o a los espacios de tejido. Las secciones de la muestra deben ser lo más delgadas posible para facilitar el contacto antígeno-anticuerpo y el examen microscópico. Las sustancias de la muestra que interfieren con la reacción antígeno-anticuerpo deben eliminarse por completo y se debe prestar atención a la seguridad de las muestras infecciosas.
Las muestras clínicas habituales incluyen principalmente tejidos, células y bacterias. Se pueden hacer frotis, impresiones o secciones a partir de diferentes muestras. El material de tejido se puede preparar en secciones de parafina o secciones congeladas. Las secciones de parafina rara vez se utilizan debido a operaciones complejas, resultados inestables y fuertes reacciones no específicas. Las muestras de tejido también se pueden imprimir. El método consiste en utilizar un portaobjetos lavado para presionar suavemente la sección de tejido de modo que se adhieran de 1 a 2 capas de células de tejido al portaobjetos. Se pueden convertir células o bacterias en un frotis, que debe ser fino y uniforme. Una vez realizado el frotis o la impresión, se debe secar rápidamente y empaquetar. Conservar a -10°C o utilizar inmediatamente.
7.2 Agregue tinción de anticuerpos fluorescentes a la muestra fijada dejando caer un anticuerpo fluorescente adecuadamente diluido. Incubar en una caja húmeda a una temperatura determinada durante un período de tiempo determinado, generalmente 30 minutos a 25 ~ 37 °C y durante la noche a 4 °C para detectar antígenos termolábiles. Lavar abundantemente con PBS y secar.
7.3 Microscopía de fluorescencia Las muestras teñidas con anticuerpos fluorescentes deben observarse bajo un microscopio de fluorescencia. Es mejor realizar un examen microscópico el día de la tinción para evitar que la decoloración de la fluorescencia afecte los resultados.
La microscopía de fluorescencia debe realizarse en una habitación oscura y bien ventilada. Primero, elige una buena fuente de luz o filtro. La correcta selección de filtros es una condición importante para obtener buenos resultados de observación de fluorescencia. Se utiliza un conjunto de filtros de excitación delante de la fuente de luz para proporcionar una luz de excitación adecuada. Hay dos tipos de filtros de excitación. MG es un filtro UV que solo permite el paso de luz UV con una longitud de onda de 275 ~ 400 nm, con una transmitancia máxima de 365 nm. BG es un filtro UV azul que solo permite el paso de luz azul con una longitud de onda de 325 ~ 500 nm, con una transmitancia máxima de 410 nm. Se utiliza un conjunto de filtros de bloqueo (también llamados filtros de absorción o filtros de supresión) cerca del ocular para filtrar la luz de excitación, permitiendo que solo pase la fluorescencia. El rango de transmisión de luz es de 410 ~ 650 nm y los códigos son OG (amarillo anaranjado) y GG (amarillo verde claro). Se pueden utilizar el filtro de excitación BG12 y el filtro de absorción OG4 o GG9 para observar la etiqueta FITC. Al observar la marca RB200, puede elegir BG12 con OG5.
7.4 Tipo de experimento: 1. Método directo: coloque anticuerpos fluorescentes específicos directamente sobre la muestra para unirse específicamente al antígeno (Figura 171). Este método es simple de operar, tiene alta especificidad y tiene pocos factores de tinción fluorescente no específicos. La desventaja es que la sensibilidad es baja y es necesario preparar los correspondientes anticuerpos fluorescentes específicos para cada antígeno.
Figura 171 Diagrama esquemático de inmunofluorescencia directa.
2. El método indirecto se puede utilizar para detectar antígenos y anticuerpos. El principio se muestra en la Figura 172. Hay dos anticuerpos en este método, el primer anticuerpo es un anticuerpo específico contra el antígeno y el segundo anticuerpo (anticuerpo fluorescente) es un antianticuerpo contra el primer anticuerpo. Este método es muy sensible y requiere sólo un anticuerpo fluorescente para detectar diferentes antígenos.
Figura 172 Diagrama esquemático de inmunofluorescencia indirecta.
Figura 173 Diagrama esquemático del principio de inmunofluorescencia de fijación del complemento
3. Método de fijación del complemento Este método es el primer paso del método indirecto. Durante la reacción antígeno-anticuerpo, se agrega complemento (principalmente complemento de cobaya) y luego se utilizan anticuerpos anticomplemento marcados con fluorescencia para el seguimiento (Figura 173). Este método es muy sensible y requiere sólo un anticuerpo. Sin embargo, es probable que se produzcan tinciones no específicas y el complemento es inestable cada vez que se debe recolectar suero de cobaya fresco, lo que complica la operación. Por eso se usa menos.
4. Método de etiquetado Este método utiliza FITC y rodamina para marcar diferentes anticuerpos, y la misma muestra se somete a tinción fluorescente.
En presencia de dos antígenos correspondientes, se pueden ver simultáneamente colores fluorescentes rojo anaranjado y verde amarillo.
Aplicación de la tecnología de anticuerpos fluorescentes en laboratorios médicos La tecnología de anticuerpos fluorescentes se ha utilizado en laboratorios clínicos para la detección de bacterias, virus y parásitos y el diagnóstico de enfermedades autoinmunes. Se utiliza principalmente para la identificación de especies bacterianas en exámenes bacteriológicos. Los materiales de muestra pueden ser cultivos, tejidos infectados, secreciones de pacientes, etc. En comparación con otros métodos serológicos para identificar bacterias, este método es más rápido, más simple y más sensible, pero solo puede usarse como medio auxiliar en el diagnóstico de pruebas bacterianas y no puede reemplazar el diagnóstico convencional. La tinción con anticuerpos fluorescentes tiene buenos resultados en el diagnóstico experimental de Neisseria meningitidis, Shigella Dysenteriae, Vibrio cholerae, Brucella y Bacillus anthracis. La tinción fluorescente indirecta se puede utilizar para determinar anticuerpos en suero y se puede utilizar en investigaciones epidemiológicas y diagnóstico clínico retrospectivo. La detección por inmunofluorescencia de anticuerpos contra Treponema pallidum es uno de los métodos comunes para el diagnóstico específico de la sífilis. La tecnología de inmunofluorescencia es de gran importancia en los exámenes virológicos porque los virus no se pueden ver con microscopios ópticos comunes, pero la tinción con anticuerpos fluorescentes puede detectar virus y sus propágulos.
La tinción indirecta con anticuerpos fluorescentes se utiliza ampliamente para el diagnóstico de infecciones parasitarias. Actualmente, la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) se reconoce como el método más eficaz para detectar anticuerpos contra la malaria. Un antígeno común es el antígeno esquizonte de eritrocitos que se encuentra en la sangre de los pacientes con malaria. La IFAT también tiene un alto valor diagnóstico para la amebiasis extraintestinal, especialmente el absceso hepático amebiano. Los antígenos utilizados fueron suspensiones de cultivos de amebas o antígenos solubles extraídos.
La inmunofluorescencia también es una buena herramienta para detectar autoanticuerpos y se utiliza ampliamente en el diagnóstico experimental de enfermedades autoinmunes. Su destacada ventaja es que puede detectar simultáneamente anticuerpos y componentes tisulares que reaccionan específicamente con los anticuerpos de una manera sencilla, y puede detectar simultáneamente anticuerpos contra diferentes componentes tisulares en el mismo tejido. Existen principalmente anticuerpos antinucleares, anticuerpos antimúsculo liso y anticuerpos antimitocondriales. Para la detección de anticuerpos antinucleares, el hígado de ratón se utiliza más comúnmente como antígeno nuclear, que se puede preparar en secciones congeladas, impresiones u homogeneizados. Los anticuerpos anticentrómero y los anticuerpos plasmáticos antineutrófilos también se pueden detectar en frotis de células de cultivo de tejidos, como las células Hep2 o las células HeLa. Otros autoanticuerpos que pueden detectarse mediante técnicas de inmunofluorescencia incluyen anticuerpos anticélulas parietales, anticuerpos antiADN bicatenario, anticuerpos antitiroglobulina, anticuerpos microsomales antitiroideos, anticuerpos antimielomialgia y anticuerpos antiadrenales.