Objetivo: Estudiar y establecer métodos de prueba de límite microbiano para preparaciones antifúngicas azólicas. Métodos: Se utilizó una solución mixta que contenía histidina, lecitina y polisorbato 80 como diluyente y líquido de lavado, y se utilizó el método de precipitación centrífuga y el método de filtración por membrana para probar el límite microbiano de estos fármacos, y se verificó el método. Resultados: La verificación se realizó de acuerdo con el apéndice de la edición de 2005 de la Farmacopea China. Los resultados mostraron que las tasas de recuperación de todas las cepas estaban por encima de 70 y las bacterias positivas de las bacterias de control también crecieron bien. Conclusión: Es factible utilizar una solución mixta que contenga histidina, lecitina y polisorbato 80 como diluyente y líquido de lavado, y utilizar métodos de sedimentación centrífuga y recolección de bacterias combinados con el método de filtración por membrana para realizar pruebas de límite microbiano de preparaciones antifúngicas azólicas.
[Palabras clave] Preparación de medicamentos antimicóticos azólicos; prueba de límite microbiano; método de recolección bacteriana centrífuga; método de filtración por membrana
medicamentos antimicóticos pirrol, como nitrato de tebuconazol y clotrimida azol, con amplio espectro. actividad antifúngica de espectro, tiene buena actividad antibacteriana contra dermatofitos, Trichophyton spp., Aspergillus spp., hongos colorantes, Cryptococcus spp. Este tipo de fármaco interfiere con la actividad del citocromo P-450, inhibe la biosíntesis de ergosterol, el esterol principal en la membrana celular del hongo, daña la membrana celular del hongo, cambia su permeabilidad y provoca la fuga de importantes sustancias intracelulares. También pueden inhibir la biosíntesis de triacilglicerol y fosfolípidos, inhibir las actividades de oxidasas y peroxidasas, provocar la acumulación de peróxido de hidrógeno intracelular y provocar la degradación de la ultraestructura celular y la necrosis celular. Estos medicamentos también tienen cierto efecto inhibidor sobre las bacterias. De acuerdo con los requisitos nacionales actuales, es necesario establecer métodos de inspección de límites microbianos para las preparaciones farmacéuticas que no requieren esterilización, incluidas las preparaciones farmacéuticas antibacterianas y antifúngicas. Sin embargo, dado que este tipo de fármaco tiene una fuerte actividad antibacteriana, cómo eliminar su actividad antibacteriana para que la prueba pueda realizarse sin problemas se ha convertido en un punto clave extremadamente importante y difícil a la hora de establecer el método. El autor de este artículo seleccionó preparaciones antimicóticas de azoles (como nitrato de tebuconazol y clotrimazol) que actualmente no son adecuadas para pruebas de límite microbiano en China para investigación experimental. Después de muchos experimentos, se centró en investigar y optimizar la composición del líquido de lavado y el volumen de lavado. Finalmente, haciendo referencia a la Farmacopea Europea, se determinó que se utilizó como diluyente y solución de lavado una solución mixta que contenía histidina, lecitina y polisorbato 80, y se combinó el método de recolección bacteriana por sedimentación centrífuga con el método de filtración por membrana. Por lo tanto, se estableció y verificó metodológicamente un método de prueba de límite microbiano para preparaciones farmacéuticas de nitrato de tebuconazol y clotrimazol. Los resultados muestran que este método es razonable y factible.
1 Reactivos e instrumentos
1.1 Prueba de reactivos
Tres lotes de crema vaginal de nitrato de tebuconazol, tres lotes de crema vaginal de clotrimazol de dos fabricantes Tabletas, tres lotes de La crema de clotrimazol compuesta, tres lotes de crema de clotrimazol y tres lotes de crema de acetato de miconazol son medicamentos disponibles comercialmente. El medio de caldo nutritivo, el medio de Martin modificado, el medio de agar nutritivo, el medio de agar de sodio rosa, el medio de lactosa de sales biliares, el medio de agar de bromuro de cetiltrimetilamina y el medio de agar de cloruro de sodio y manitol están disponibles para su compra en el Instituto para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos de China. Histidina, lecitina, polisorbato 80, peptona, cloruro de sodio, dihidrógeno fosfato de potasio e hidrógeno fosfato disódico son reactivos y reactivos analíticos disponibles comercialmente. Staphylococcus aureus [CMCC(B)26003], Bacillus subtilis [CMCC(B)63501], Escherichia coli [CMCC(B)44102], Pseudomonas aeruginosa [CMCC (b) 10102]. Aspergillus niger [CMCC(F)98003], las cepas anteriores se adquirieron en la sala de cepas del Instituto Chino para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos. De acuerdo con los requisitos del apéndice de la "Farmacopea China" (edición de 2005), las cinco cepas verificadas anteriormente se convirtieron en líquido bacteriano y el contenido bacteriano por 1 ml fue de 50 a 100 ufc.
1.2 Instrumentos
Mesa de trabajo de limpieza, aspirador médico, centrífuga de baja velocidad, etc.
2 Métodos y resultados
2.1 Resultados de las pruebas del método de recolección del apéndice de la Farmacopea
Los medicamentos anteriores se trataron con cloro estéril, un diluyente de uso común recomendado en la edición de 2005. de la Farmacopea China. La solución tampón de cloruro de sodio y peptona se convirtió en una solución de prueba 1:10 y se utilizaron varios métodos de tratamiento para eliminar el efecto bacteriostático del fármaco.
Es decir, método de dilución del medio de cultivo (tomar 0,2 ml de solución de prueba 1:10 o tomar 0,2 ml de solución de prueba 1:100 e inyectarlos en una placa de Petri), método de sedimentación centrífuga y utilizar tampón de peptona y cloruro de sodio estéril con pH 7,0. como solución de lavado se combinan el método de filtración por membrana, el método de recolección de bacterias por sedimentación centrífuga y el método de filtración por membrana. Entre ellos, se utilizó como líquido de lavado una solución tampón de cloruro de sodio-peptona estéril con pH 7,0, y el volumen total de lavado alcanzó 65438 ± 0000 ml. Los resultados de la determinación de la tasa de recuperación de la prueba combinada de sedimentación centrífuga y filtración por membrana bacteriana se muestran en la Tabla 1.
2.2 Determinación de la tasa de recuperación
Incluso si se utiliza el método de sedimentación centrífuga combinado con el método de filtración por membrana, 4 de las 5 cepas verificadas todavía tienen una tasa de recuperación de cero, lo que indica que el antifúngico azol Los medicamentos son Las bacterias y los hongos tienen un fuerte efecto inhibidor, o la membrana del filtro tiene un fuerte efecto de adsorción sobre estos medicamentos. Las soluciones de lavado que se usan actualmente son difíciles de lavar y varios métodos de tratamiento domésticos comúnmente utilizados no son adecuados para estos medicamentos.
2.3 Comparación de los efectos de diferentes fórmulas de diluyente y solución de lavado
Con referencia a la Farmacopea China (edición 2005) [1] y la Farmacopea Europea (5ª edición) [2 ], prepare los siguientes 5 diluyentes y soluciones de enjuague, como se muestra en la Tabla 2.
Seleccione un lote de tabletas vaginales de clotrimazol y pruebe los cinco diluyentes y líquidos de lavado anteriores en secuencia. La sedimentación centrífuga y la recolección bacteriana se combinaron con la filtración por membrana y se compararon los efectos experimentales. Consulte la Tabla 3 para obtener más detalles.
Los resultados anteriores muestran que es satisfactorio utilizar la solución de fórmula de la Farmacopea Europea y lecitina como reactivos importados, o utilizar la solución casera número 5 como diluyente y solución de lavado para eliminar el efecto antibacteriano del fármaco. Sin embargo, cuando se reemplazó la lecitina por un reactivo doméstico, la solución no se pudo filtrar porque estaba turbia. Cuando la dosis de lecitina y polisorbato 80 se reduce a la mitad de la Farmacopea Europea, la claridad de la solución no se ve afectada por la calidad de los reactivos y el efecto de lavado también puede cumplir con los requisitos experimentales. 2.4 Método de preparación
2.4.1 Según el método establecido por los resultados de la prueba anteriores, tomar 10 g de la muestra de prueba y agregar una solución mixta que contenga histidina-lecitina-polisorbato 80 estéril (ver método de preparación) para 100 ml, mantener la temperatura a 45°C, agitar bien hasta que la muestra de prueba esté uniformemente dispersa y preparar una solución de prueba uniforme de 1:10. Los recuentos de bacterias, mohos y levaduras se combinan mediante centrifugación y filtración por membrana. Tome 50 ml de la solución madre 1:10, centrifugue a 500 rpm durante 5 minutos, tome todo el sobrenadante, agregue la mezcla anterior a 50 ml, centrifugue a 3000 rpm durante 20 minutos, tome aproximadamente 5 ml de la colección bacteriana del fondo, y mezcle Agregue la mezcla anterior a 50 ml, que es 1:6544. Tome 1 ml de la solución de prueba de 1:10, agréguelo a los 100 ml de solución mixta anterior, fíltrelo todo con un filtro de membrana, use la solución mixta anterior como solución de lavado, lave 100 ml cada vez, * * * tres veces, tome la membrana del filtro, inspeccione de acuerdo con la ley (Farmacopea China)
2.4.2 Las bacterias de control (como Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, etc.) deben inspeccionarse mediante sedimentación centrífuga y filtración por membrana. Tome 10 ml de la solución de prueba bajo el número de colonia 1:10 anterior, agréguelo a la mezcla de 100 ml anterior y fíltrelo todo con un filtro de membrana. El método de lavado es el mismo que para el recuento de colonias bacterianas. Inocular la membrana del filtro en el medio de cultivo correspondiente e inspeccionarla de acuerdo con la ley (Farmacopea China, edición de 2005, Apéndice VII J).
2.4.3 Método de preparación de la solución mixta estéril de histidina-lecitina-polisorbato 80: polisorbato 80 15 g, lecitina 1,5 g, histidina 0,5 g, peptona 0,5 g, cloruro de sodio 2,15 g, dihidrogenofosfato de potasio 1,8 g , hidrogenofosfato disódico 3,6 g, agua 65438.
2.5 Prueba de verificación
El método establecido anteriormente se verificó de acuerdo con los requisitos del apéndice de la edición de 2005 de la Farmacopea China.
2.5.1 Verificación de los métodos de recuento de bacterias, moho y levaduras: tome 1 ml de los cinco líquidos bacterianos anteriores y utilice el método de recuento en placa para determinar el número de bacterias viables por ml en el líquido bacteriano preparado. líquido. Grupo de control de prueba: Tome 1 ml de solución de prueba 1:10, agregue 100 ml de la solución mezclada anterior, filtre todo con una membrana de filtro, lave con el método anterior, tome la membrana de filtro, incube a la temperatura especificada y cuente .
Grupo de prueba: tome 1 ml de solución de prueba 1:10 y la operación es la misma que la del grupo de control de prueba. Agregue 1 ml de la solución bacteriana anterior (50~100 bacterias de prueba ufc) a la solución del tercer enjuague, retire la membrana del filtro, cultívela a la temperatura especificada, cuente y calcule la tasa de recuperación, consulte la tabla. Grupo de control de diluyente: tome 10 ml de las cinco soluciones bacterianas anteriores (500 ~ 1000 bacterias de prueba ufc), realice la misma operación que el grupo de control y calcule la tasa de recuperación, consulte la Tabla 4. Calcule la tasa de recuperación () de acuerdo con la siguiente fórmula:
Los experimentos anteriores muestran que la tasa de recuperación de cada bacteria de verificación cumple con los requisitos del Apéndice de la Farmacopea, lo que indica que es factible utilizar este método para contar bacterias, mohos y levaduras.
2.5.2 Grupo de prueba de verificación del método de inspección de bacterias de control: tomar 10 ml de la solución de prueba 1:10 anterior, agregarla a la mezcla de 100 ml anterior, filtrarlo todo con una membrana de filtro, agregar el filtro membrana al medio de cultivo correspondiente. El cultivo de enriquecimiento se realizó en ml y se usó como muestra de prueba. Grupo de control en blanco: Tome 65438±00 ml de la solución mixta anterior y opere igual que el grupo de control en blanco de diluyente. Grupo de control bacteriano negativo: tomar 10 ml de la solución de prueba, agregarla a la mezcla anterior y filtrar todo con una membrana filtrante. El método de limpieza es el mismo que el anterior, pero se añaden bacterias de control negativo apropiadas a la tercera solución de limpieza (por ejemplo, se selecciona Escherichia coli como bacteria de control negativo para el examen de Staphylococcus aureus). Grupo de control bacteriano positivo: tomar 10 ml de la solución de prueba, agregarla a la mezcla anterior y filtrar todo con una membrana filtrante. El método de lavado es el mismo que el anterior, pero por tercera vez (10 ~ 65448), se agregan bacterias apropiadas (como Staphylococcus aureus) al líquido de lavado.
Los grupos anteriores se cultivaron a 35 ~ 37 ℃ durante 18 ~ 24 horas, se dibujaron rayas en los medios de cultivo correspondientes y luego se cultivaron a 35 ~ 37 ℃ durante 18 ~ 24 horas. el grupo de control de bacterias positivas creció bien, lo que indica que este tipo de fármaco no tiene efecto antibacteriano o su efecto antibacteriano puede ignorarse después de este tratamiento. No se detectaron bacterias negativas, lo que indica que el método de control de bacterias es específico y factible.
3 Discusión
Este estudio experimental muestra que los fármacos azoles tienen fuertes efectos antibacterianos tanto sobre bacterias como sobre hongos. Para estos fármacos con fuerte actividad antimicrobiana, primero se deben explorar métodos para eliminar sus efectos bacteriostáticos antes de poder examinar con éxito sus límites microbianos.
Si se utiliza la filtración por membrana para comprobar los límites microbianos de los productos farmacéuticos, el tipo y la cantidad de diluyente y solución de enjuague son muy importantes e incluso pueden determinar la aplicabilidad del método. Como diluyentes y fluidos de lavado para pruebas de límite microbiano, no solo deben disolver los medicamentos, sino también mantener la permeabilidad de la membrana celular bacteriana, reparar las células dañadas y destruir el daño de las células bacterianas causado por los medicamentos. La histidina es una de las fuentes importantes de nitrógeno para el crecimiento de Candida albicans en la fórmula detergente determinada en este experimento. La lecitina juega un papel importante en la reparación de las membranas celulares; el polisorbato 80, como surfactante, puede reducir la tensión superficial entre la periferia bacteriana y la superficie de contacto del medio de cultivo, permitiendo que los nutrientes periféricos ingresen a la célula más rápido, promoviendo así el crecimiento bacteriano. y realizar otras actividades rápidamente. La combinación de lecitina y polisorbato 80 puede neutralizar agentes bacteriostáticos y el producto neutralizado tiene poco efecto sobre las bacterias y los medios de cultivo. Por lo tanto, agregar estas sustancias a diluyentes y soluciones de lavado puede reducir efectivamente el efecto inhibidor de los medicamentos sobre bacterias y hongos y promover el crecimiento de bacterias y hongos dañados.
Existen ciertas diferencias de calidad entre algunos reactivos y reactivos nacionales y los importados. La fórmula detergente registrada en la Farmacopea Europea contiene una gran cantidad de lecitina y polisorbato 80. Cuando se formula con productos domésticos, la solubilidad no es buena, provocando que la solución quede turbia. Cuando el volumen de lavado es grande, la velocidad de filtración de la solución es lenta, lo que afecta el efecto de lavado e incluso puede imposibilitar la filtración. Este problema se puede resolver eficazmente reduciendo la cantidad de cada componente en la fórmula. Se ha verificado que incluso si la dosis de cada componente de la fórmula se reduce a la mitad, el efecto aún puede satisfacer las necesidades experimentales y la velocidad de filtración es adecuada, lo que también puede reducir el costo experimental.
[Referencias]
[1]Comité Nacional de Farmacopea. Farmacopea china. Segunda parte. Beijing: Chemical Industry Press, 2005. Apéndice 93.
[2] Farmacopea Europea. Quinta edición. Apéndice 16B.A377.