En el vector pET, bajo el control de fuertes señales de transcripción y traducción, el gen de interés se clona en el fago T7 y la ARN polimerasa T7 se proporciona en el célula huésped. inducir su expresión. El sistema para mascotas de Novagen continúa expandiéndose, ofreciendo nuevas tecnologías y opciones de expresión. Actualmente, * * * incluye 36 tipos de vectores, 15 bacterias huésped diferentes y muchos otros productos relacionados, diseñados para detectar y purificar eficazmente proteínas diana.
Ventajas
Es el sistema más citado para la expresión de proteínas procarióticas.
El nivel de expresión básico es el más bajo de cualquier sistema de expresión de E. coli.
Verdadero control "reóstato" para ajustar los niveles de expresión
Muchas etiquetas de fusión diferentes y configuraciones de sistemas de expresión disponibles.
Vectores especializados y bacterias huésped para la producción de proteínas solubles, formación de enlaces disulfuro, transporte de proteínas y producción de péptidos.
Muchos vectores se proporcionan en kits de vectores LIC para la clonación direccional rápida de productos de PCR.
Muchas cepas huésped se proporcionan como células competentes listas para la transformación.
El sistema de clonación directa pFORCE TM tiene las características de clonación eficiente de productos de PCR, selección positiva de recombinantes y expresión eficiente de proteínas diana.
Descripción general del sistema PET
El sistema PET es el sistema más eficiente para clonar y expresar proteínas recombinantes en E. coli. Basado en el sistema impulsado por el promotor T7 desarrollado originalmente por Studier et al., el sistema pET de Novagen se ha utilizado para expresar miles de proteínas diferentes.
Controlar el nivel de expresión básico
El sistema PET proporciona seis combinaciones de bacterias vector-huésped, que pueden optimizar la expresión del gen objetivo ajustando el nivel de expresión básico. No existe una estrategia o condición única que funcione para todas las proteínas objetivo, por lo que es necesaria una selección optimizada.
Cepa huésped
Después de que el plásmido se construye en una cepa huésped sin expresión, el gen de la ARN polimerasa T7 generalmente se usa para transformar la cepa huésped (lisozima λ DE3) para expresar la proteína objetivo. En la lisozima lambda DE3, el gen de la ARN polimerasa T7 está controlado por el promotor lacUV5. Existe un cierto grado de transcripción sin ser inducido, por lo que es adecuado para expresar ciertos genes y sus productos no tienen ningún efecto tóxico sobre el crecimiento de las células huésped. Pero cuando la bacteria huésped porta pLysS y pLyE, las regulaciones serán más estrictas. El plásmido PLys codifica la lisozima T7, un inhibidor natural de la ARN polimerasa T7, lo que reduce su capacidad para transcribir genes diana en células no inducidas. La cepa huésped PLysS produce una pequeña cantidad de lisozima T7, mientras que la cepa huésped Plyss produce una gran cantidad de enzima, por lo que es la lisozima λ DE3 más estrictamente controlada.
Existen 11 bacterias huésped lisogénicas DE3 diferentes. BL21 y sus cepas derivadas se utilizan ampliamente y tienen la ventaja de carecer de proteasas lon y ompT. La cepa B834 es auxotrófica para la metionina, por lo que se pueden utilizar 35 S-metionina y selenometionina para marcar proteínas diana con alta actividad específica. BLR es una cepa derivada de recA que aumenta la producción de monómeros plasmídicos y ayuda a estabilizar los plásmidos diana que contienen secuencias repetidas. Dos cepas mutantes de tiorredoxina reductasa (trxB) (AD494, BL21 trxB) favorecen la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma de E. coli. Las cepas Origami TM y OrigamiB son mutaciones dobles de trxB/gor, que son enzimas clave en la vía de reducción principal. La principal ventaja de los anfitriones Origami y OrigamiB es la capacidad de formar proteínas correctamente plegadas que contienen enlaces disulfuro. La nueva cepa Rosetta TM complementa el ARNt con cuatro codones raros en E. coli, mejorando la baja expresión de algunas proteínas eucariotas causada por diferentes frecuencias de uso de codones. Otras cepas incluyen K-12 HMS174 y NovaBlue, que son BLR similares a recA. Estas cepas pueden expresar de manera estable ciertos genes diana y sus productos pueden provocar la pérdida del fago DE3.
NovaBlue es una cepa huésped estrecha y útil debido a la proteína represora lacIq de alta afinidad codificada por el apéndice F. Además, Novagen también proporciona un kit de lisógeno λ DE3 para preparar bacterias huésped de nueva expresión con otros antecedentes genéticos. Un enfoque alternativo para expresar genes altamente tóxicos o preparar nuevos lisosomas lambda DE3 es proporcionar ARN polimerasa T7 mediante infección con lCE6. Aunque esto no es tan conveniente como inducir la lisozima lambda DE3 mediante IPTG, esta estrategia también se prefiere en algunas aplicaciones.
Promotor T7 lac de alta rigurosidad
Además de la elección de tres rigurosidades de expresión básicas a nivel de la bacteria huésped, el promotor T7 en el propio sistema pET proporciona dos selecciones rigurosas diferentes: ordinaria Promotor T7 y promotor T7 lac. El promotor lac de T7 contiene un operador lac de 25 pb, 17 pb corriente abajo de la región promotora. La unión de la proteína represora lac en este sitio reduce efectivamente la transcripción por la ARN polimerasa T7, que proporciona un segundo mecanismo basado en lacI (además de lacUV5) para inhibir la expresión basal en la lisozima lambda DE3. Los plásmidos PET que contienen el promotor lac T7 también tienen su propio lacI, lo que garantiza una unión suficiente de la proteína represora al sitio operador.
En aplicaciones prácticas, para obtener el mayor rendimiento proteico, a menudo es necesario probar varias combinaciones de bacterias vector/huésped.
Control de los niveles de expresión inducida
En muchos casos, la expresión de proteínas con actividad y solubilidad óptimas depende del entorno de la célula huésped, las condiciones de cultivo y la configuración adecuada del vector. A menudo, las condiciones que producen la mayor actividad de la proteína objetivo no coinciden con las condiciones que producen los mayores rendimientos. Además de controlar la expresión básica de la ARN polimerasa T7 basada en la combinación de vector y bacteria huésped, el sistema pET también proporciona un verdadero control "reostato" para la expresión de la proteína diana basada en la concentración del inductor (IPTG). Las mutaciones LacY en las bacterias huésped sintonizador y OrigamiB hacen posible este control.
Elija un transportador para mascotas
Todos los vectores pET se derivan de pBR322, pero difieren en secuencias líder, señales de expresión, etiquetas de fusión, sitios de restricción asociados y otras propiedades. Hay dos tipos de plásmidos pET, vectores de transcripción y vectores de traducción:
Los vectores de transcripción (incluidos pET-21, pET-23 y pET-24) expresan ARN diana pero no proporcionan una señal de traducción. Se utilizan para expresar proteínas de genes diana con señales de traducción bacterianas. (Nota: los vectores de transcripción se distinguen por el sufijo de letra que falta después del nombre).
Los vectores de traducción contienen señales de iniciación de traducción eficientes diseñadas para la expresión de proteínas. Muchos vectores tienen sitios de clonación en los marcos de lectura A, B y C, correspondientes al triplete GGA, GAT y ATC del sitio BamHI, respectivamente.
Puntos clave en la selección
La selección de un vector pET para expresión a menudo implica muchos factores. Considere los siguientes tres factores principales:
Propósito de la proteína expresada
Qué se sabe sobre la proteína expresada
Estrategia de clonación
pET vector Las proteínas expresadas tienen múltiples usos. Por ejemplo, las proteínas con niveles de expresión analíticos se pueden utilizar para estudios de actividad, detección y caracterización de mutantes, detección de interacciones de ligandos y preparación de antígenos. Una gran cantidad de proteínas activas se utilizan para estudios estructurales, reactivos o preparación de matrices de afinidad. Muchos vectores son adecuados para la expresión de proteínas de ensayo para el cribado o la preparación de antígenos, pero sólo se pueden utilizar para la purificación a gran escala cuando la combinación de vector, cepa huésped y condiciones de cultivo es adecuada. Si se requiere una producción alta y constante de proteína activa, se deben probar varias combinaciones de vectores, bacterias huésped y condiciones de cultivo para encontrar resultados óptimos.
Cualquier información conocida sobre la proteína objetivo ayudará en la selección del vector. Por ejemplo, la actividad de algunas proteínas requiere la ausencia de secuencias extrañas en uno o ambos extremos. Muchos vectores pET pueden clonar secuencias que no son de fusión. Sin embargo, si una secuencia de inicio de traducción específica no se usa de manera eficiente en E. coli, los niveles de expresión pueden verse afectados.
En estos casos, las proteínas de fusión a menudo pueden construirse a partir de secuencias amino-terminales expresadas eficientemente y luego, después de la purificación, la secuencia de fusión se digiere con proteasas específicas de sitio. La estrategia LIC (clonación independiente de la ligadura) es particularmente útil para este método porque la operación de clonación elimina todas las secuencias codificantes del vector amino terminal mediante enteroquinasa y factor Xa.
La estrategia de clonación también afecta la selección de vectores debido a la compatibilidad del sitio de restricción y del marco de lectura. Debido a que muchos vectores pET tienen la misma configuración de sitio de restricción, un gen diana preparado una vez normalmente puede clonarse en varios vectores. Existen diferentes consideraciones al emplear una estrategia de clonación por PCR. Para ello se recomienda el kit de vectores LIC. Los insertos pueden prepararse mediante PCR sin restricción de digestión del vector o inserto.
Solubilidad y Localización Celular
Considerando la aplicación y estrategia de clonación de la proteína diana, es muy importante determinar la localización celular y la solubilidad de la proteína diana. En muchas aplicaciones prácticas, suele ser necesario expresar proteínas activas solubles.
La solubilidad de proteínas diana específicas depende de muchos factores, incluidas sus respectivas secuencias proteicas. En muchos casos, la solubilidad no es un fenómeno de presencia o ausencia, y el vehículo, la bacteria huésped y las condiciones de cultivo pueden usarse para aumentar o disminuir la proporción de forma soluble o insoluble obtenida. La serie de vectores PET-32 fusiona la secuencia objetivo con tiorredoxina (Trx). Tag), que suele aumentar la proporción de proteína soluble. La serie pET-43.1 recientemente lanzada tiene un socio de fusión: Nus. Tag, una proteína de E. coli con alta solubilidad cuando se sobreexpresa, se obtuvo mediante un examen sistemático exhaustivo, mejorando así aún más la solubilidad de la proteína objetivo. Además, los mutantes trxB AD494 y BL21 trxB, o las cepas trxB/gor origamit y OrigamiB se pueden utilizar para formar enlaces disulfuro necesarios para el correcto plegamiento y actividad de muchas proteínas eucariotas en el citoplasma. La inducción a baja temperatura (15-25 ℃) también puede aumentar la proporción de proteína objetivo soluble.
Otra estrategia para obtener proteínas activas solubles es secretar la proteína al periplasma celular, lo que proporciona un entorno más adecuado para el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro. Para ello se suelen utilizar vectores con péptidos señal.
Algunas estrategias de purificación pueden optimizar el rendimiento de cuerpos de inclusión insolubles en el citoplasma. Los cuerpos de inclusión se extraen y se solubilizan, y luego la proteína diana se vuelve a plegar in vitro (por ejemplo, utilizando el kit de plegado de proteínas de Novagen). Este proceso normalmente produce altos rendimientos de proteína inicial y previene la degradación de proteínas en la célula huésped. Sin embargo, la eficiencia del replegamiento en proteínas activas varía mucho entre las diferentes proteínas y puede ser bastante baja. El vector PET-31b ( ) está diseñado específicamente para la producción de proteínas de fusión insolubles, proporcionando un método eficiente para la producción de pequeñas proteínas y péptidos.
Etiquetas de fusión para satisfacer diferentes necesidades
Si la secuencia de fusión no afecta la aplicación, utilice S.Tag y T7 para producir proteínas de fusión. Etiqueta a, el suyo. Etiqueta a y HSV. Tag a facilitará las operaciones posteriores y facilitará la detección de la hibridación de proteínas. Estos péptidos (las secuencias de fusión son muy pequeñas) y sus reactivos de detección son extremadamente específicos y sensibles. Impuesto sobre Bienes y Servicios. Etiqueta, Etiqueta S y T7. Las secuencias de etiquetas se pueden utilizar para la purificación por afinidad utilizando los kits de resina y tampón correspondientes.
Mediante el uso de S.Tag y GST, se pueden cuantificar con precisión proteínas de fusión crudas o purificadas. Suite de análisis de etiquetas. El kit de ensayo FRETWorks S.Tag con sustratos novedosos puede detectar menos de 1 fmol de proteína de fusión mediante fluorescencia.
El suyo. La secuencia Tag a es muy útil como compañero de fusión para proteínas purificadas, especialmente para aquellas proteínas expresadas en forma de cuerpos de inclusión. Puede hacer posible la purificación por afinidad en condiciones en las que la proteína solubilizada está completamente desnaturalizada.
CBD. La etiqueta A es muy útil en la purificación por afinidad de bajo costo. También son particularmente útiles para replegarse (especialmente pET-34b () y 35b () con secuencia de etiqueta de cierre de CBD).
Debido a que solo el CBD replegado correctamente se une a la matriz de celulosa, el paso de purificación por afinidad CBIND elimina las moléculas plegadas incorrectamente de la preparación. Se puede utilizar cualquier etiqueta para inmovilizar la proteína diana, pero es más adecuada para este propósito debido a su unión no específica a la matriz de celulosa y su menor biocompatibilidad.
Universidad Nacional. Etiqueta, Trx. Etiquetas y GST. La secuencia de etiqueta se utiliza para aumentar la solubilidad de su compañero de fusión. Universidad Nacional. Etiquetas y transacciones. El portador de la etiqueta es compatible con las bacterias huésped del origami y facilita la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma.
Consulta varias etiquetas de fusión y las correspondientes listas de transportadores de mascotas. Algunos transportadores de mascotas llevan varias etiquetas de fusión ** como compañeros de fusión de 5'. Además, muchos vectores expresan proteínas de fusión con diferentes etiquetas polipeptídicas en los extremos a través del marco de lectura de la secuencia del gen diana. Se pueden eliminar selectivamente una o más etiquetas después de la purificación usando vectores que contienen sitios de escisión de proteasas (trombina, factor Xa y enteroquinasa) entre la etiqueta 5' y la secuencia diana. PET-30 Ek/LIC, pET-32 Ek/LIC, pET-34 Ek/LIC y pET-36 Ek/LIC son buenos representantes de la localización celular y las configuraciones de etiquetas de afinidad. El kit combinado de vectores pET Ek/LIC incluye los cuatro vectores listos para usar que se pueden usar directamente para construir varias configuraciones de genes objetivo.
PET NusA Fusion System 43.1
Producción de proteínas activas solubles en E. coli
El sistema de fusión pET NusA recientemente introducido está diseñado para clonación y alto nivel. expresión Secuencia polipeptídica fusionada a 495aa NusA (Nus). etiqueta) proteína. Según el modelo de solubilidad de más de 4000 proteínas en la base de datos, se confirmó que la proteína NusA tiene la mayor solubilidad. En experimentos con cuatro proteínas de fusión NusA diferentes, más del 85% de las proteínas expresadas eran solubles. El vector PET-43.1 contiene Nus. El compañero de fusión de la etiqueta, y compatible con los mutantes trx/gor Origami y OrigamiB, facilita la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma. Usando una combinación del vector pET-43.1 y estas bacterias huésped trx/gor, es posible obtener proteínas unidas por disulfuro.
Ventajas
Nus N-terminal altamente soluble. Etiqueta Fusion Partner
Su upstream. Etiqueta A, etiqueta S. y HSV con terminal C opcional. Etiqueta a, el suyo. Etiqueta de fusión de etiquetas.
Sitios de escisión de trombina y enteroquinasa
En todos los marcos de lectura se encuentran múltiples sitios de clonación.
Compatible con las cepas huésped AD494 y Origami para favorecer el correcto plegamiento de las proteínas expresadas.
Células competentes de la cepa huésped de mascota
Todas las cepas huésped del sistema pET se proporcionan en forma de células competentes previamente probadas que se pueden utilizar inmediatamente para la transformación.
(DE3) significa que el huésped es la lisozima λ DE3 y su cromosoma tiene una copia del gen de la ARN polimerasa T7 controlado por el promotor lacUV5. Esta cepa es adecuada para la producción de proteínas a partir del gen de interés clonado en el vector pET. Las bacterias huésped denominadas pLysS y pLysE portan plásmidos compatibles con pET que codifican la lisozima T7, un inhibidor natural de la ARN polimerasa T7. Las células con pLysS producen pequeñas cantidades de lisozima, mientras que las bacterias huésped pLysE producen grandes cantidades de la enzima. Estas cepas se utilizan para inhibir la expresión basal de la ARN polimerasa T7 antes de la inducción, lo que estabiliza los recombinantes de pET que codifican proteínas diana que afectan el crecimiento y la viabilidad celular. Las bacterias huésped que albergan pLacI producen proteínas represoras lac adicionales que inhiben la expresión básica de los vectores pETBlue y pTriEx. El kit de lisógeno λ DE3 se utiliza para preparar bacterias huésped de nueva expresión de otros orígenes genéticos.
La cepa AD494 es una cepa mutante de la tiorredoxina reductasa (trxB), que puede formar enlaces disulfuro en el citoplasma, proporcionando el potencial de producir proteínas activas correctamente plegadas.
Las mutaciones TrxB pueden seleccionarse mediante kanamicina, por lo que esta cepa se recomienda para plásmidos que portan el marcador de resistencia a ampicilina bla.
B834 es la cepa parental de BL21. Estas bacterias huésped deficientes en proteasas son deficientes en metionina, y la proteína diana puede marcarse con 35 S-metionina y selenometionina de alta actividad específica, que puede usarse para estudios cristalográficos.
BL21, la fuente de bacterias huésped más utilizada, tiene la ventaja de carecer de proteasas lon y ompT.
La cepa BL21 TrxB tiene la misma mutación de tiorredoxina reductasa (TrxB) que la cepa AD494 en un entorno BL21 deficiente en proteasa. Dado que los huéspedes trxB favorecen la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma, su uso puede aumentar la proporción de proteínas correctamente plegadas. Las mutaciones TrxB pueden seleccionarse mediante kanamicina, por lo que esta cepa se recomienda para plásmidos que portan el marcador de resistencia a ampicilina bla.
Las cepas derivadas de RecA con BLR de BL21 pueden aumentar el rendimiento de monómeros plasmídicos y ayudar a estabilizar los plásmidos diana que contienen secuencias repetitivas o sus productos que conducen a la pérdida del fago DE3.
La cepa HMS174 proporciona la mutación recA sobre el fondo K-12. Al igual que BLR, estas cepas pueden estabilizar algunos genes diana, cuyos productos pueden provocar la pérdida del fago DE3.
NovaBlue es adecuado para la cepa K-12 como cepa huésped de clonación inicial, con alta eficiencia de transformación, capacidad de detección de manchas azules/blancas (con plásmidos apropiados) y mutación recA endA que da como resultado altos rendimientos de alta ADN plasmídico de calidad. La lisozima DE3 de NovaBlue es una cepa huésped muy útil debido a la presencia de la proteína represora lacI q codificada por F-attach.
Origami es una cepa huésped derivada de K-12. Las mutaciones en los genes de la tiorredoxina reductasa (trxB) y la glutatión reductasa (gor) son mutaciones que mejoran en gran medida la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma. Los estudios han demostrado que Origami (DE3) expresa 10 veces más proteína activa que otras bacterias huésped, incluso si los niveles generales de expresión son similares. Las cepas huésped de origami son compatibles con plásmidos de resistencia a ampicilina y pueden usarse como vectores pET-32. El marcaje con tioredoxina puede mejorar aún más la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma. Las mutaciones TrxB y gor pueden seleccionarse mediante kanamicina y tetraciclina respectivamente, por lo que esta cepa se recomienda para plásmidos pET con marcador de resistencia a ampicilina bla.
La cepa huésped Origami B se deriva del mutante lacZY BL21 y tiene la misma mutación TrxB/gor que la cepa Origami original. La cepa Origami B combina las ventajas de las cepas huésped BL21, Tuner y Origami. Las mutaciones TrxB y gor pueden seleccionarse mediante kanamicina y tetraciclina respectivamente, por lo que esta cepa se recomienda para plásmidos pET con marcador de resistencia a ampicilina bla.
La cepa huésped Rosetta se deriva de BL21 y puede potenciar la expresión de proteínas eucariotas con codones raros en E. coli. Esta cepa se complementa con ARNt para los codones AUA, AGG, AGA, CUA, CCC y GGA con un plásmido de resistencia al cloranfenicol compatible. De esta manera, las cepas Rosetta proporcionan una traducción "universal", evitando así las limitaciones de expresión provocadas por la frecuencia de uso de codones de E. coli. Los genes TRNA son impulsados por sus promotores nativos. En Rosetta (DE3) pLysS y Rosetta (DE3) pLacI, genes de ARNt raros están presentes en el mismo plásmido que los genes represores de lisozima T7 y lac, respectivamente.
La cepa Tuner es un mutante por deleción lacZY de BL21 que modula los niveles de expresión de proteínas en todas las células en cultivo. La mutación Lac permeasa (lacY) permite que IPTG entre de manera uniforme en todas las células de la población y, por lo tanto, tiene una expresión dependiente de la concentración e inducida uniformemente.
Al ajustar la concentración de IPTG, la expresión se puede modular desde niveles muy bajos hasta niveles de expresión muy fuertes y completamente inducidos (generalmente asociados con vectores pET). La expresión de bajo nivel a veces puede mejorar la solubilidad y la actividad de proteínas difíciles de expresar. La cepa pLacI Tuner (DE3) es compatible con la expresión de los vectores pETBlue y pTriEx.
Purificación de proteínas recombinantes
/Experimento/Protein 4/86143.shtml