La expresión, purificación y elucidación estructural de proteínas es un proceso complejo que implica múltiples pasos experimentales. Generalmente, los principales pasos para la expresión, purificación y análisis de estructura de proteínas son:
Expresión y purificación de proteínas
1. Clonación de genes y construcción de vectores de expresión:
( 1) para clonar y amplificar la secuencia del gen diana.
(2) Insertar el gen diana en un vector de expresión apropiado, como un plásmido recombinante o un vector viral.
(3) Construir un vector de expresión, incluido el promotor, el marcador de selección y otros elementos de control de expresión apropiados.
2. Cultivo celular y expresión de proteínas:
(1) Transformar el vector de expresión en una célula huésped adecuada (como E. coli, etc.).
(2) Cultivar las bacterias transformadas en condiciones de cultivo adecuadas para expresar la proteína diana. Los métodos de cultivo comunes incluyen el cultivo por lotes, el cultivo en matraz agitado y el cultivo en fermentador.
3. Disrupción celular y extracción de proteínas:
(1) Utilice métodos apropiados para alterar las células bacterianas, como la disrupción ultrasónica o la disrupción a alta presión, para liberar las proteínas objetivo.
(2) Para extraer proteínas del lisado celular, se pueden utilizar centrifugación, filtración y otras técnicas para la separación preliminar.
4. Purificación de proteínas:
(1) Seleccionar el método de purificación adecuado según las propiedades de la proteína objetivo, como cromatografía de afinidad, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, etc. .
(2) A través de pasos de purificación continuos, se eliminan las impurezas y se purifica la proteína objetivo.
5. Experimentos de análisis estructural:
(1) El análisis de la estructura de proteínas puede utilizar una variedad de métodos experimentales, como la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear (RMN) y el microscopio electrónico. etc.
(2) Para la cristalografía de rayos X, la proteína debe cristalizarse en condiciones adecuadas y la imagen de difracción debe obtenerse mediante tecnología de difracción de rayos X. Luego, se utilizan métodos computacionales para resolver la estructura tridimensional de la proteína.
(3) La RMN permite analizar la estructura de proteínas mediante su interacción con señales de resonancia magnética nuclear en solución.
(4) Los microscopios electrónicos pueden observar imágenes directas de proteínas y obtener información sobre su forma y estructura.
Los pasos experimentales para la expresión, purificación y análisis de estructura de proteínas incluyen la clonación de genes y la construcción de vectores de expresión, el cultivo celular y la expresión de proteínas, la disrupción celular y la extracción de proteínas, la purificación de proteínas y experimentos de análisis de estructuras. Diferentes proteínas y propósitos de investigación pueden requerir técnicas y procedimientos específicos.