2. Modificación postraduccional: Muchas proteínas producidas por expresión de ARNm deben sufrir modificaciones postraduccionales, como la fosforilación, la glicosilación y la activación del zimógeno. La modificación postraduccional es una forma importante para que las proteínas regulen sus funciones, por lo que el estudio de las modificaciones postraduccionales de las proteínas juega un papel importante para dilucidar las funciones de las proteínas.
3. Determinación de la función proteica: como análisis de la actividad enzimática y determinación de sustratos enzimáticos, análisis biológico de citocinas/análisis de unión ligando-receptor. Se pueden utilizar tecnologías de desactivación genética y antisentido para analizar la función de la proteína producida por la expresión génica. Además, estudiar la localización de las proteínas en las células después de su expresión puede ayudar a comprender hasta cierto punto la función de las proteínas. El sistema de expresión de proteínas fluorescentes de Clontech es una excelente herramienta para estudiar la localización de proteínas en las células.
4. En lo que respecta a los seres humanos, la investigación proteómica servirá en última instancia para la salud humana, lo que significa principalmente promover el desarrollo de la medicina molecular. Por ejemplo, buscando moléculas diana de fármacos. Muchos fármacos son proteínas y las moléculas diana de muchos fármacos son proteínas. Las drogas también pueden interferir con las interacciones proteína-proteína.
En el estudio de la medicina básica y los mecanismos de las enfermedades, es de gran importancia comprender las características de expresión genética de diferentes etapas de desarrollo, diferentes condiciones fisiológicas y patológicas y diferentes tipos de células. Estos estudios pueden descubrir moléculas directamente relacionadas con condiciones fisiológicas o patológicas específicas y, además, sentar las bases para diseñar fármacos que actúen sobre moléculas diana específicas. La expresión genética de diferentes tipos de células es inconsistente en diferentes etapas de desarrollo y bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas, por lo que el estudio de la expresión de proteínas debe ser preciso a nivel celular o incluso subcelular. Se pueden utilizar técnicas inmunohistoquímicas para lograr este objetivo, pero su inconveniente fatal es el bajo rendimiento. La tecnología de microdisección por captura láser (LCM) puede extraer con precisión los tipos de células que interesan a los investigadores a partir de secciones de tejido, por lo que la tecnología LCM es en realidad una tecnología in situ. Las células extraídas se utilizaron para preparar muestras de proteínas. Combinada con un chip de anticuerpos o una tecnología de electroforesis-espectrometría de masas bidimensional, la expresión de proteínas se puede estudiar in situ mediante un alto rendimiento. Muchos estudios utilizan tejido homogeneizado para preparar muestras de proteínas y la conclusión es cuestionable porque las proteínas de diferentes tipos de células se mezclan después del tejido homogeneizado y los datos finales de la investigación no pueden explicar en absoluto la expresión de las proteínas en cada tipo de célula. Aunque se puede obtener un solo tipo de célula cultivando células, es difícil para las células cultivadas in vitro simular el entorno de las células del cuerpo, por lo que las conclusiones extraídas de este estudio son difíciles de interpretar la situación real del cuerpo. Por lo tanto, en la investigación, primero debemos aislar diferentes tipos de células. Los diferentes tipos de células aisladas pueden usarse para la investigación de expresión genética, incluida la expresión de ARNm y proteínas.
Las células obtenidas mediante tecnología LCM se pueden utilizar para preparar muestras de proteínas. Proteína total, proteína de membrana, proteína nuclear, etc. Puede prepararse según sea necesario, enriquecer las glicoproteínas o reducir la complejidad de los tipos de proteínas eliminando la albúmina. El kit correspondiente lo proporciona el fabricante. Se pueden separar diferentes tipos de proteínas en una muestra de proteínas mediante electroforesis bidimensional. La electroforesis bidimensional puede separar diferentes tipos de proteínas con alta resolución basándose en diferencias en el punto isoeléctrico y el peso molecular. La electroforesis bidimensional exitosa puede separar de 2000 a 3000 proteínas. El gel después de la electroforesis se somete a tinciones altamente sensibles, como tinciones con plata, tinciones fluorescentes, etc. Si desea comparar las similitudes y diferencias en la expresión de proteínas entre dos muestras, puede preparar las muestras de proteínas de las dos muestras en las mismas condiciones, luego realizar una electroforesis bidimensional en las mismas condiciones y comparar los dos geles después de la tinción. También es posible etiquetar las muestras de proteínas de dos muestras con diferentes tintes fluorescentes, luego usar electroforesis bidimensional para separar las dos muestras de proteínas en un gel y, finalmente, usar tecnología de escaneo de fluorescencia para analizar los resultados.
Después de la tinción en gel, puede utilizar el sistema de análisis de imágenes de gel para obtener imágenes y luego utilizar el software de análisis para analizar cuantitativamente los puntos de proteínas y localizar los puntos de proteínas de interés. A través de un sistema especial de corte de manchas de proteínas, se puede cortar con precisión la zona del gel donde se encuentra la mancha de proteínas. Luego, las proteínas del gel se digieren mediante digestión enzimática y, después del procesamiento de desalación/concentración, las proteínas se pueden detectar en la superficie de un material específico (MALDI-TOF) mediante un sistema de detección. Finalmente, estas proteínas se pueden analizar en un sistema de espectrometría de masas para obtener datos cualitativos sobre la proteína. Estos datos se pueden utilizar para construir una base de datos o compararlos con bases de datos existentes.
La ruta tecnológica LCM-electroforesis bidimensional-espectrometría de masas es una ruta tecnológica típica para la investigación proteómica.
Además, el chip de anticuerpos LCM también es una ruta técnica importante para la investigación proteómica. Es decir, mediante tecnología LCM se obtiene el tipo de célula de interés y se preparan muestras de proteínas celulares. Etiquete la proteína con un tinte fluorescente e hibridela con un chip de anticuerpo, para que pueda comparar las similitudes y diferencias en la expresión de proteínas entre las dos muestras. Clontech desarrolló recientemente un chip de anticuerpos que puede analizar 378 proteínas de membrana y citoplasmáticas. Al mismo tiempo, el chip está equipado con reactivos importantes para todo el funcionamiento del chip de anticuerpos, incluidos reactivos de preparación de proteínas, reactivos de etiquetado de tintes fluorescentes de proteínas, reactivos de purificación del sistema de etiquetado, reactivos de hibridación, etc.
Para el estudio de las interacciones entre proteínas, la tecnología de dos híbridos de levadura y de presentación en fagos son, sin duda, buenos métodos de investigación. El sistema de dos híbridos de levadura desarrollado por Clontech y la tecnología de visualización de fagos desarrollada por NEB están disponibles para los investigadores.
Para la investigación del proteoma, algunas o todas las proteínas del proteoma también se pueden convertir en chips de proteínas. Este chip de proteínas se puede utilizar para estudios de interacción de proteínas, estudios de expresión de proteínas y estudios de unión de proteínas de moléculas pequeñas. "Science", Volumen 293, Número 5537, 2101-2105, publicó un artículo sobre chips de proteína de levadura el 14 de septiembre de 2001. El contenido principal del artículo es el siguiente: expresar 5800 ORF de levadura en proteínas, luego purificarlas en chips y luego usar los chips para detectar moléculas que interactúan con las moléculas de calmodulina y fosfolípidos.
Por último, cabe señalar que la investigación tradicional sobre proteínas se centra en proteínas individuales, mientras que la proteómica se centra en todas las especies de proteínas involucradas en un estado fisiológico o patológico específico y su relación con el entorno circundante (moléculas). Por lo tanto, los estudios proteómicos suelen ser de alto rendimiento. Para cumplir con este requisito, las herramientas de investigación relacionadas con la proteómica suelen ser sistemas altamente automatizados con alto rendimiento y velocidad. Con el software de análisis y las bases de datos adecuados, los investigadores pueden procesar la mayor cantidad de datos en el menor tiempo.